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【系列一】IPHASE/汇智和源 体外药代动力学研究热点问题解答
2023-07-21
体外药代动力学研究
Q：在代谢稳定性研究中，需要使用肝微粒体和原代肝细胞两个试验系统进行试验吗？
A：肝微粒体是肝组织在匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，包含了CYP450酶和一些二相酶，如UGTs、ST等。原代肝细胞(Primary hepatocytes)是指从动物肝脏直接分离后立即培养的肝细胞，基本维持了肝脏的代谢功能，特别是较好的保留了与体内一致的酶水平。在代谢稳定性研究中，不需要考虑成本，可同时选择两种试验系统进行试验；也可根据化合物的代谢特性选择合适的试验系统，原则是哪个系统代谢速率高选哪个。一般情况下，化合物分子水溶性较强、一相代谢为主要代谢途径（尤其是经由CYP）等情况下，肝微粒体为最优选择；二相代谢为主要途径、水解作用为主要代谢途径、肝微粒体中非特异性蛋白结合很高、肝微粒体中代谢不明显的时候，可使用原代肝细胞进行试验。
Q：代谢稳定性试验中微粒体浓度是考察过的吗?过高或过低有什么影响呢？
A:：在代谢稳定性试验中，蛋白浓度也会影响代谢速率，通常选择的微粒体蛋白浓度为0.1mg/mL~1mg/mL，具体选用多大蛋白浓度需根据化合物自身代谢特性去选择。微粒体蛋白浓度过高，会导致药物和微粒体蛋白非特异性的结合；而微粒体浓度过低，则可能导致药物的代谢不明显。
Q：非特异性蛋白结合对试验结果有什么影响？
A：如果候选药物与微粒体蛋白发生非特异性结合，则会导致动力学参数的改变。随着蛋白浓度的增加，Km值也会增大，从而造成推测的内在清除率偏低。同时，候选药物与微粒体中蛋白的结合，也会造成不同实验室和不同体系结果差异较大。
Q：药物只做一相代谢可代谢10%，只做二相代谢也只代谢10%，但使用二相代谢试剂盒却可代谢50%，如何解释？
A：药物的生物转化，分为一相代谢反应和二相代谢反应。药物在一相代谢反应中主要发生氧化、还原和水解的反应，经过一相代谢反应，药物可能带有一些极性基团，如羟基、羧基等。二相代谢，又称结合反应，一相代谢产物或原型药物在酶的影响下与内源性小分子发生结合，使药物毒性、活性降低或极性增加而易于排出的反应。一般来说，药物先进行一相反应进行转化，如果极性依然较弱，则会启动二相反应，但有些药物可直接进行二相反应。所以，才会有以上现象的存在。
Q：半衰期和清除率怎么计算？
A：将受试物在0min浓度作为100%，各时间点的受试物浓度与0min浓度相比得到剩余百分数。各时间点的受试物剩余百分数的自然对数与孵育时间经线性回归，求得斜率(k)，由公式求得各种属微粒体中的消除半衰期t1/2和体外肝微粒体中的固有清除率Clint in vitro。
Q：原代肝细胞代谢稳定性试验细胞密度推荐多少？清除率计算和肝微粒体一样的吗？
A：原代肝细胞代谢稳定性试验推荐的细胞密度为0.5~2×106个/mL，清除率计算和肝微粒体代谢稳定性试验的结果处理方法是一致的。
Q：代谢稳定性研究试剂盒中阳性底物的作用是什么？孵育时间点应如何设置？
A: 试剂盒中阳性底物的作用主要是为了证实试剂盒的有效性。孵育时间点的设置主要看是基于什么试验目的，若只是为了验证孵育系统是否正常工作，仅需设置0点和一个非零时间点即可；若需考察阳性底物的代谢稳定性特征，则需设置0点和3~5个非零时间点。
Q：肝微粒体试验中，孵育时是否要开盖保证有氧气的参与？
A：理论上来讲，一相代谢反应是有氧反应，需要有氧气的供应，我们内部曾做过验证，孵育时开不开盖对结果没有影响。
Q：代谢稳定性试验中必须要有镁离子吗？镁美离子的作用是什么啊？
A：代谢稳定性研究可以有肝微粒体和原代肝细胞两种试验系统可供选择。如果使用原代肝细胞为试验系统不需要添加镁离子，如果选择肝微粒为试验系统则需要添加镁离子来辅助代谢，镁离子可以有效的提高酶的活性。
Q：代谢产物鉴定试验中孵育时间该如何选择？
A：代谢产物鉴定的试验系统需与代谢稳定性试验保持一致。如果选用肝微粒体为试验系统，孵育时间通常控制在60min内(最长不超过2h)；如果选用肝细胞为试验系统，孵育时间需控制在120min内(最长不超过4h)，在设定的孵育时间内调整肝微粒体的加入量或肝细胞的终浓度，让药物的剩余量控制在10%~50%的范围内，以保证有足量的代谢产物生成而便于进行产物推断。
Q：代谢稳定性药物浓度一般为1μM，代谢产物鉴定一般10μM，这个浓度如果体内远远达不到该怎么办？
A：在代谢稳定性试验的目的是得到半衰期和体外清除率的数据，从而推断体内的清除率。理论上，孵育浓度低至<<Km值时，测得的Clint就基本上不在变化了，而大部分化合物的Km>>1μM，故一般未知化合物都会选1μM进行试验；代谢产物鉴定试验提高化合物的浓度的目的是能够有足量的产物生成而利于产物鉴定。如果体内达不到，可以根据实际情况进行调整。
Q：一相代谢和二相代谢所用的缓冲液是不一样的吗？PBS和Tris缓冲液？
A：有文献报导，对于大多数UGT酶亚型，由于PBS缓冲液会降低其选择性和酶活性，所以二相代谢中选用了Tris缓冲液，故导致了一相代谢和二相代谢所使用的缓冲液有差异。
Q：如果需要同时考察一相和二相代谢，试验系统应如何选择？
A：如果要同时考察一相和二相代谢，选择原代肝细胞作为试验系统是最好的选择。原代肝细胞具有完整的细胞结构，不需要额外添加辅助因子，可以很好的模拟体内的代谢情况。
Q：磷酸盐缓冲液的目的是什么啊？为什么要磷酸根呢？
A；磷酸盐缓冲液的目的是模拟生理环境，磷酸根是维持体内体液环境最重要的缓冲对之一，故选择了磷酸根。
Q：0min的代谢点总是会发生代谢反应，该如何处理？
A：建议先加入终止液，再启动代谢反应。
—热点问题—
Q：在代谢稳定性研究中，需要使用肝微粒体和原代肝细胞两个试验系统进行试验吗？
A：肝微粒体是肝组织在匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，包含了CYP450酶和一些二相酶，如UGTs、ST等。原代肝细胞(Primary hepatocytes)是指从动物肝脏直接分离后立即培养的肝细胞，基本维持了肝脏的代谢功能，特别是较好的保留了与体内一致的酶水平。在代谢稳定性研究中，不需要考虑成本，可同时选择两种试验系统进行试验；也可根据化合物的代谢特性选择合适的试验系统，原则是哪个系统代谢速率高选哪个。一般情况下，化合物分子水溶性较强、一相代谢为主要代谢途径（尤其是经由CYP）等情况下，肝微粒体为最优选择；二相代谢为主要途径、水解作用为主要代谢途径、肝微粒体中非特异性蛋白结合很高、肝微粒体中代谢不明显的时候，可使用原代肝细胞进行试验。
Q：代谢稳定性试验中微粒体浓度是考察过的吗?过高或过低有什么影响呢？
A:：在代谢稳定性试验中，蛋白浓度也会影响代谢速率，通常选择的微粒体蛋白浓度为0.1mg/mL~1mg/mL，具体选用多大蛋白浓度需根据化合物自身代谢特性去选择。微粒体蛋白浓度过高，会导致药物和微粒体蛋白非特异性的结合；而微粒体浓度过低，则可能导致药物的代谢不明显。
Q：非特异性蛋白结合对试验结果有什么影响？
A：如果候选药物与微粒体蛋白发生非特异性结合，则会导致动力学参数的改变。随着蛋白浓度的增加，Km值也会增大，从而造成推测的内在清除率偏低。同时，候选药物与微粒体中蛋白的结合，也会造成不同实验室和不同体系结果差异较大。
Q：药物只做一相代谢可代谢10%，只做二相代谢也只代谢10%，但使用二相代谢试剂盒却可代谢50%，如何解释？
A：药物的生物转化，分为一相代谢反应和二相代谢反应。药物在一相代谢反应中主要发生氧化、还原和水解的反应，经过一相代谢反应，药物可能带有一些极性基团，如羟基、羧基等。二相代谢，又称结合反应，一相代谢产物或原型药物在酶的影响下与内源性小分子发生结合，使药物毒性、活性降低或极性增加而易于排出的反应。一般来说，药物先进行一相反应进行转化，如果极性依然较弱，则会启动二相反应，但有些药物可直接进行二相反应。所以，才会有以上现象的存在。
Q：半衰期和清除率怎么计算？
A：将受试物在0min浓度作为100%，各时间点的受试物浓度与0min浓度相比得到剩余百分数。各时间点的受试物剩余百分数的自然对数与孵育时间经线性回归，求得斜率(k)，由公式求得各种属微粒体中的消除半衰期t1/2和体外肝微粒体中的固有清除率Clint in vitro。
Q：原代肝细胞代谢稳定性试验细胞密度推荐多少？清除率计算和肝微粒体一样的吗？
A：原代肝细胞代谢稳定性试验推荐的细胞密度为0.5~2×106个/mL，清除率计算和肝微粒体代谢稳定性试验的结果处理方法是一致的。
Q：代谢稳定性研究试剂盒中阳性底物的作用是什么？孵育时间点应如何设置？
A: 试剂盒中阳性底物的作用主要是为了证实试剂盒的有效性。孵育时间点的设置主要看是基于什么试验目的，若只是为了验证孵育系统是否正常工作，仅需设置0点和一个非零时间点即可；若需考察阳性底物的代谢稳定性特征，则需设置0点和3~5个非零时间点。
Q：肝微粒体试验中，孵育时是否要开盖保证有氧气的参与？
A：理论上来讲，一相代谢反应是有氧反应，需要有氧气的供应，我们内部曾做过验证，孵育时开不开盖对结果没有影响。
Q：代谢稳定性试验中必须要有镁离子吗？镁美离子的作用是什么啊？
A：代谢稳定性研究可以有肝微粒体和原代肝细胞两种试验系统可供选择。如果使用原代肝细胞为试验系统不需要添加镁离子，如果选择肝微粒为试验系统则需要添加镁离子来辅助代谢，镁离子可以有效的提高酶的活性。
Q：代谢产物鉴定试验中孵育时间该如何选择？
A：代谢产物鉴定的试验系统需与代谢稳定性试验保持一致。如果选用肝微粒体为试验系统，孵育时间通常控制在60min内(最长不超过2h)；如果选用肝细胞为试验系统，孵育时间需控制在120min内(最长不超过4h)，在设定的孵育时间内调整肝微粒体的加入量或肝细胞的终浓度，让药物的剩余量控制在10%~50%的范围内，以保证有足量的代谢产物生成而便于进行产物推断。
Q：代谢稳定性药物浓度一般为1μM，代谢产物鉴定一般10μM，这个浓度如果体内远远达不到该怎么办？
A：在代谢稳定性试验的目的是得到半衰期和体外清除率的数据，从而推断体内的清除率。理论上，孵育浓度低至<<Km值时，测得的Clint就基本上不在变化了，而大部分化合物的Km>>1μM，故一般未知化合物都会选1μM进行试验；代谢产物鉴定试验提高化合物的浓度的目的是能够有足量的产物生成而利于产物鉴定。如果体内达不到，可以根据实际情况进行调整。
Q：一相代谢和二相代谢所用的缓冲液是不一样的吗？PBS和Tris缓冲液？
A：有文献报导，对于大多数UGT酶亚型，由于PBS缓冲液会降低其选择性和酶活性，所以二相代谢中选用了Tris缓冲液，故导致了一相代谢和二相代谢所使用的缓冲液有差异。
Q：如果需要同时考察一相和二相代谢，试验系统应如何选择？
A：如果要同时考察一相和二相代谢，选择原代肝细胞作为试验系统是最好的选择。原代肝细胞具有完整的细胞结构，不需要额外添加辅助因子，可以很好的模拟体内的代谢情况。
Q：磷酸盐缓冲液的目的是什么啊？为什么要磷酸根呢？
A；磷酸盐缓冲液的目的是模拟生理环境，磷酸根是维持体内体液环境最重要的缓冲对之一，故选择了磷酸根。
Q：0min的代谢点总是会发生代谢反应，该如何处理？
A：建议先加入终止液，再启动代谢反应。
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