原代肝细胞常见问题

2023-11-02

Q：代谢稳定性研究中微粒体和肝细胞该如何选择？是不是只需要选择其中一个就可满足要求？ 

A：在代谢稳定性研究中，选肝微粒体还是选肝细胞，主要还是要看化合物的代谢特性，谁代谢速率高选谁。一般情况下，优先选用肝微粒体，尤其是在化合物分子水溶性较强、一相代谢为主要代谢途径（尤其是经由CYP）等情况下，肝微粒体为最优选择。当有证据显示二相代谢为主要途径、水解作用为主要代谢途径、肝微粒体中非特异性蛋白结合很高、肝微粒体中代谢不明显的时候，可使用肝细胞进行实验。通常情况下，选择一个代谢系统即可满足需求，若各方面条件允许，两个系统同时选择肯定是最好的。 

Q：为什么酶诱导试验必须选用原代肝细胞进行？ 

A：CYP酶诱导的试验，需要从“转录（Transcription）”到“翻译（Translation）”到“蛋白质翻译后修饰”直至成为活性CYP酶蛋白，所以其试验系统是肝细胞，而非肝微粒体或肝S9。 

Q：酶诱导试验为什么需要选择三个供体的人原代肝细胞？ 

A：根据《药物相互作用指导原则》介绍，至少采用三个供体，每个供体的诱导结果应单独评估。选择三个供体进行实验，除了使结果具有统计学意义外，更重要的也是为了评估个体间的差异，如果至少一个供体的结果超过了预定的阈值，则在研药物可能具有诱导作用，需进行后续评估。 

Q：为什么只关注CYP酶的诱导，而不关注UGT酶的诱导? 

A:只关注CYP酶的诱导是因为对CYP酶的诱导机制已经研究的较为清楚，而没有要求对UGT酶的诱导进行研究是由于目前对其机制还不是很清楚，并不是说它不会被诱导。指导原则中也有说到，对于转运体以及 II 相代谢酶的诱导剂或者抑制剂还没有标准化的分类系统。 
  
Q：贴壁原代肝细胞复苏之后可以存活多久，如果肝细胞复苏后不做贴壁培养可以维持多久？ 

A： （1）贴壁原代肝细胞一般用于酶诱导试验，细胞复苏后使用铺板培养基悬浮，调整细胞至适宜浓度后使用胶原包被板进行培养，一般在4~6小时内细胞可进行贴壁。细胞贴壁后，更换维持培养基继续维持18h，以保证细胞状态能最大程度恢复。接下来，即可开展酶诱导试验，并进行代谢活性和mRNA诱导水平的检测。从整个周期来看，肝细胞贴壁后可以维持6~7天状态，且随时间延长细胞贴壁状态变差，细胞会出现脱落悬浮现象。 
（2）如果贴壁肝细胞不进行贴壁培养，我们验证过在4~6小时内是可以维持在较好的状态，更长时间的验证我们还暂时未开展。 

Q：是不是因为使用的培养基的不同，肝细胞既能当作悬浮细胞使用，又能当成贴壁细胞使用呢？ 

A：大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁，但不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁。细胞贴壁与否首先会与细胞本身状态有关；同时贴壁细胞也需要特定培养基及一些特殊的促细胞附着物质（如鼠尾胶原、如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程）等。也就是说，贴壁细胞我们可以作为悬浮细胞使用，但悬浮细胞不一定可用于贴壁使用。 

Q：贴壁和悬浮肝细胞使用的优缺点是什么？在具体试验过程中应该如何选择呢？

 

A：肝细胞被分离后，可进行悬浮培养或贴壁培养。悬浮培养的原代肝细胞在最开始的4~6h内细胞色素P450酶的活性最为和体内一致，随时间的延长而迅速下降，故悬浮肝细胞一般用于代谢稳定性研究或代谢物谱研究。贴壁培养的原代肝 
细胞有足够的时间从损伤中恢复过来，保持了正常肝细胞的生物学特征及代谢活性，一般用于酶诱导研究、药物细胞毒性研究、慢代谢药物的代谢稳定性或产物推断研究。