体外哺乳动物细胞微核试验常见问题——《药物遗传毒性研究技术指导原则》
2021-10-15
体外哺乳动物细胞微核试验常见问题——《药物遗传毒性研究技术指导原则》
2021-10-15
（四）体外哺乳动物细胞微核试验（In vitro mammalian cell micronucleus test）
1.细胞
可采用哺乳动物或人的细胞进行试验，如CHL细胞、CHO细胞、TK6细胞、人外周血淋巴细胞等。细胞系需定期检查核型和有无支原体污染等。-80℃或液氮冻存备用。
2.浓度
至少应包含3个可用于结果分析的浓度。
最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度：
（1）对于可溶性的无细胞毒性的受试物，推荐的最高浓度一般为1mM或0.5mg/ml （选用较低者）。
（2）对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度。最高浓度所产生的细胞毒性应达到约50%。无细胞松弛素B（Cyto B）时通过RICC、RPD的减少来反映细胞毒性，有细胞松弛素B时通过分裂阻滞增殖指数（cytokinesis-block proliferation index，CBPI）或复制指数（Replication index，RI）来反映细胞毒性。
（3）对于难溶性的受试物，若无细胞毒性，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；若细胞毒性出现在最小沉淀浓度以上，一般建议只检测1个沉淀浓度，因为沉淀可能产生干扰。
对最高浓度之下的其他浓度，对于细胞毒性小或无的受试物，一般浓度间距为2～3倍；对于有细胞毒性的受试物，所选择的浓度应覆盖产生细胞毒性的范围，并且包括具有中度或少/无细胞毒性的浓度；在一些情况下，如受试物具有较陡峭的浓度反应关系，则可适当缩小浓度间距或将检测的浓度增加至3个以上。
每一浓度一般平行2皿；若能获得足够细胞数，可用单皿，尤其当受试物超过3个检测浓度。
3.代谢活化
一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终浓度一般为1%～10%（v/v）。
4.对照
代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性诱变剂。
5.方法
处理及细胞收获时间：在代谢或非代谢活化的情况下，受试物和细胞作用3～6小时，加或不加细胞松弛素B（Cyto B）在1.5～2.0个正常细胞周期时收获细胞；在非代谢活化条件下，加或不加Cyto B受试物和细胞还应持续作用至1.5～2.0个正常细胞周期时收获细胞。对于某些受试物，与细胞接触时间/收获细胞时间可能要大于1.5个正常细胞周期。
读片分析：每个浓度应至少观察2000个双核细胞（加Cyto B）或单核细胞（不加Cyto B），分析微核率。应至少观察500个细胞，加Cyto B时通过CBPI或RI来评价其细胞毒性，不加Cyto B时通过RICC或RPD来评价细胞毒性。
也可采用已经过充分验证的自动化分析系统（如流式细胞术、激光扫描细胞计数仪、图像分析系统）对微核进行检测。
6.结果判定
结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况；结果表示为微核率。
受试物在任一处理条件下一个或多个浓度组微核率显著增加，增加具有浓度依赖性，且微核率在阴性对照历史范围之外，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学分析有助于结果的评价。
如果结果不是明确的阳性或阴性结果，或者为了帮助确定结果的生物学意义，应对数据进行专家同行评议和/或进一步研究。分析更多的细胞（当可行时），或者通过改变试验条件进行重复试验（如改变试验浓度间距、改变代谢活化条件等）可能是有用的。
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