小核酸药物凭借其独特的技术特点成为近年来新药研发领域关注的焦点，是目前发展最为迅猛的基因疗法之一。与传统的小分子药物和抗体药物相比，小核酸药物能够从源头进行干预，具有靶点筛选快、治疗效率高、不易产生耐药性、效果持久、药物毒性低、特异性强、研发成功率高等优点，被认为将带来“除小分子药和抗体药”之外的第三次制药浪潮。

然而，作为新的一类药物分子，小核酸药物极性大、带电荷、需要借助化学修饰和递药系统改善成药性，因而具有不同于化学小分子和抗体药物的药理学特性，为小核酸药物早期研发带来新挑战。基于此，本文将结合小核酸药物的特点阐述其体外研究方案并提供可能的解决策略，以供参考。

Keywords：Oligonucleotides、siRNA、ASO、Aptamer、miRNA、saRNA、mRNA、AOC、LNP、GalNAc、Cellular Uptake、Endosomal Escape

一、小核酸药物简介

小核酸药物，又称寡核苷酸药物（Oligonucleotides, ONs），指长度一般为18-30nt的可成药的寡核苷酸。小核酸药物包括小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）、反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotide，ASO）、微小RNA（microRNA, miRNA）、小激活RNA（small activating RNA, saRNA）、信使RNA（messenger RNA, mRNA）、核酸适配体（Aptamer）和抗体核酸偶联药物（Antibody-oligonucleotide conjugates, AOC）等。当前研究的重点主要集中于ASO、siRNA 和Aptamer这三种小核酸药物上。不同的寡核苷酸作用机制不同（图1），它们在发病的不同阶段发挥抑制剂的作用，ASO和siRNA作用于靶mRNA水平；Aptamer则直接抑制参与发病蛋白的活性。它们的共同点均为通过干预靶基因的表达以达到实现疾病治疗的目的。

图1 寡核苷酸的作用机制及作用位点（来源：Delivery of oligonucleotide-based therapeutics: challenges and opportunities）

综上，独特的作用机理使得小核酸药物拥有诸多优势：治疗效率高、靶向特异性强、药物毒性小、治疗领域广泛等，而且与小分子药物和抗体药相比，小核酸药物研发周期短、不易产生耐药性、效果持久、研发成功率较高，被认为是继小分子药和抗体药后推动医药产业变革的第三代制药创新技术，已有越来越多的医药企业投入到小核酸药物的创新研发中。

二、小核酸上市药物现状

近年来FDA已批准了多款小核酸药物，主要用于治疗罕见病。截至2023年，全球共计有16款小核酸药物获批上市，其中，10款为ASO药物；5款为siRNA药物，1款是Aptamer药物。但有2款早期ASO药物与1款Aptamer药物由于销售额过低等原因而退市，目前仍在市场的有8款ASO和5款siRNA药物。

表1 全球已上市的小核酸药物一览

三、小核酸药物研究难点

小核酸药物与小分子和抗体药物相比，分子结构、作用靶标、半衰期、分布、代谢、DDI和免疫原性都存在较大不同，这给小核酸药物的药性评价研究带来了极大的挑战。

此外，小核酸药物进入体内发挥作用，需要克服多种障碍，如结构不稳定易被体内的核酸酶降解；分子结构较大且带负电荷，穿透细胞膜难度大，很难渗透到细胞内发挥药效；从内吞体逃逸到细胞质中的逃逸效率低；具有免疫原性，激活人体免疫系统反应等。随着技术发展，以上部分难题已经有较好的解决方法，化学修饰和递送系统技术的突破对寡核苷酸药物的发展起到了至关重要的作用。其中化学修饰，如磷酸骨架、核糖、碱基修饰等可以避免核酸药物被核酸酶降解，而高效安全的递送系统，如目前应用较成功的递送系统是脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle，LNP)包裹技术及与特定配体结合实现靶向递送(如N-乙酰半乳糖胺，GalNAc)可以使核酸药物精准地靶向目标细胞并提高细胞摄取效率，使核酸药物发挥治疗功能。

目前，中国国家药品监督管理局 (NMPA)、欧洲药品管理局 (EMA) 和美国食品药品监督管理局 (FDA) 均尚无专门针对寡核苷酸药物的指导原则和技术指南, NMPA提出寡核苷酸是化学合成药物, 虽然具备生物制品的属性, 但仍按新化学实体进行监管。但目前已上市的寡核苷酸药物通常参考生物大分子对药物的免疫原性进行的考查。因此在寡核苷酸核酸类药物的药代动力学研究中，对新化学实体及大分子涉及的相关实验都需要考虑，比生物大分子药物更为复杂。

四、小核酸药物体外研究解决方案

小核酸药物的体外研究通常可从体外代谢稳定性、血浆蛋白结合、靶细胞结合和摄取、内体逃逸、靶细胞效应评价、药物与药物相互作用（DDI）与遗传毒性等方面进行考察。

4.1 体外代谢稳定性

与传统小分子药物一样，小核酸药物在临床前研究阶段，通常需要进行体外代谢稳定性研究。目前所有已上市的小核酸药物均在申报材料中提交了药物的体外代谢研究报告，以阐明药物的代谢行为。小核酸药物主要被血浆和组织中广泛存在的核酸内切酶和核酸外切酶所代谢，而不是通过肝脏的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶代谢。核酸外切酶作用于链的末端，导致单核苷酸的释放，而核酸内切酶则在链内裂解，产生不同长度的链。目前上市的小核酸药物大部分被肝脏迅速摄取，小部分分布在其他组织，在肝脏或其他组织中经由核酸酶代谢。因此，小核酸药物的体外代谢稳定性研究，可以采用肝脏代谢系统、血液循环介质、核酸酶及靶组织相关基质等试验体系。

通过将不同的试验系统与小核酸药物共孵育一定时间后检测，可获得小核酸药物在不同系统中的代谢稳定性情况。小核酸药物的代谢产物可能具有活性或者毒性，所以也需要对其代谢产物进行分析研究。可用LC-MS的方法检测小核酸原药或者代谢产物，高分辨率质谱(HRMS)，比如飞行时间质谱TOF，具有较高的分辨率、灵敏度、特异性和质量精确度等特性，可采用全扫描和多种方式的离子扫描对未知代谢产物进行定性或定量分析。样品前处理可采用液液萃取（Liquid-Liquid Extraction，LLE）和固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）两种方式，其中SPE是生物基质中提取小核酸药物最广泛使用的方法。将样品加载到被充分活化之后的SPE柱或板后，用淋洗液将蛋白质等干扰物质洗脱，随后用洗脱液将寡核苷酸相关组分洗脱下来，用于LC-MS分析。

4.2 血浆蛋白结合

在正常情况下，各种药物以一定的比率与血浆蛋白结合，在血浆中常同时存在结合型与游离型，而只有游离型药物才具有药物活性。血浆蛋白结合率（plasma protein binding, PPB）实验的主要目的即是测定药物与血浆蛋白的结合程度，即药物进入血液后，与血浆蛋白结合的药量占血液药物总量的比率‌。血浆蛋白结合率反映了药物在体内的分布情况，对于评估药物的疗效和副作用具有重要意义。‌

血浆蛋白结合对于ASO性能的影响包括组织分布和组织递送、细胞摄取、细胞内转运、药效和毒性。ASO的亲水性和序列特征可以影响它的蛋白结合程度及结合速度。低蛋白结合的ASO，其细胞摄取能力也比较低，且肾清除率较高。而对于GalNAc-siRNA来讲，尚未有明确报道与血浆蛋白结合的药理作用及对PK和药效的影响。但当有以下几种情形时，需要对其血浆PPB和血液PK之间的关系进行监测：（1）包含新的化学修饰、连接体、配体、赋形剂；（2）包含尚未在临床批准的药物中进行检测的制剂；（3）有理由认为血浆游离药物浓度可以影响PK、PD和/或安全性。

目前已报道的血浆蛋白结合测定方法中，ASO有超滤法（Ultrafiltration, UF）和超速离心法（Ultracentrifugation, UC），siRNA主要有超滤法和凝胶电泳迁移法(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)。

超滤法可以在纯血浆中进行实验，不必稀释血浆，同时保证实验过程中体系的pH接近于生理pH值。超滤法需要注意的是，如果寡核苷酸的分子量接近超滤管过滤器的截留分子量上限，回收率则会偏低。另外，寡核苷酸与小分子量的蛋白发生结合且通过了滤膜，则PPB与真实值会出现偏差。

超速离心法是使用超高速离心沉淀蛋白质和蛋白质结合的药，通过比较无蛋白上清液和完整的药物的浓度来计算游离分数。其成本相对较高，在超速离心的作用下可能改变化合物的结合平衡。

EMSA法通常使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 或琼脂糖凝胶电泳，从结合复合物中分离游离的核酸；需要注意的是，样品需要用专门的上样溶液对血浆进行稀释，蛋白结合率的准确度是否会受到稀释液的组成成分的影响有待考察；另外，核酸染色的灵敏度也会影响最终的结果。

4.3 靶细胞结合和摄取

小核酸药物必须进入细胞才能发挥药理作用。药物与靶细胞表面的蛋白结合，会从血浆中迅速清除，使其直接分布于血管外，被组织摄取，然后，通过组织细胞内吞内化至核内体，然后从早期核内体中释放出来，进入细胞质或细胞核靶向mRNA，继而发挥药效。因此，需要评估小核酸药物和靶细胞的结合和摄取情况。通常是将小核酸药物进行荧光标记，然后和靶细胞进行孵育培养，通过共聚焦荧光成像或流式细胞术进行分析。

4.4 内体逃逸（Endosomal Escape）

内体（Endosome），也称为内涵体或内吞体，是通过细胞膜的内吞过程形成的小囊泡，用于捕获并运输细胞外小核酸药物。当药物被细胞摄取时，它们经常被包裹在这些内体中。然而，要使药物在细胞内发挥作用，它们必须从内体中“逃逸”到细胞质或其他细胞器中。如果药物不能及时从内体中逃逸，内体可能会与溶酶体融合。溶酶体含有能够分解许多生物分子的酶，这可能导致小核酸药物被降解，从而失去其治疗效果。然而，小核酸药物的内体逃逸效率较低，内体所含的脂质双层可能捕获并保留约99%的RNA分子并导致其降解。据研究，仅有0.3-1%的小RNA偶联物能够自内体逃脱进入靶细胞内部，而ASO药物的内体逃逸效率也仅有1%左右。

因此，在小核酸药物研发早期，需要评估其内体逃逸效率。试验模型可选择人和动物的原代细胞等。通过观察荧光显微镜下细胞内的荧光信号分布，可以判断在研小核酸药物是否能够从溶酶体中逃逸。如果小核酸药物与溶酶体标记染料完全共定位，说明其主要存在于溶酶体中，尚未发生溶酶体逃逸；如果观察到在研小核酸药物的荧光信号分布在溶酶体之外的细胞质或细胞核等区域，且与溶酶体标记染料的分布不完全重叠，则表明其发生了溶酶体逃逸。

此外，还可以通过定量分析荧光强度的方法来进一步评估溶酶体逃逸的效率。例如，使用图像分析软件测量细胞内不同区域（如溶酶体、细胞质、细胞核）的荧光强度，并计算在研小核酸药物在溶酶体和非溶酶体区域的荧光强度比值，从而定量地比较不同实验组之间溶酶体逃逸的差异。

4.5 靶细胞效应评价（体外药效学）

体外评价小核酸药物的靶细胞效应主要是进行靶标mRNA和靶蛋白的评估及细胞表型和功能性干扰的评估。对于mRNA和蛋白质水平的评估可通过RT-qPCR和Western Blot的方法，而细胞表型和功能性干扰的评估主要是考察细胞的增值和凋亡等情况及蛋白质修饰、蛋白-蛋白相互作用等。

4.6 药物与药物相互作用（DDI）

小核酸类药物主要经核酸外切酶或内切酶代谢, 不太可能是CYPP450酶和转运体的底物、抑制剂和诱导剂。和单抗药物类似,一般情况下, 小核酸药物不是必须要开展常规的药物相互作用研究。PS骨架修饰的ASOs具有较高的血浆蛋白结合率, 但是它和非极性的化学小分子与血浆蛋白结合的位点并不相同,再考虑到血浆蛋白在人体中含量丰富,不太可能因血浆蛋白结合位点的竞争而引起药物相互作用。如果小核酸药物靶向的mRNA涉及CYP酶形成的转录翻译上游过程,那就需要开展相应的DDI研究。另外，如果小核酸药物主要通过肾脏以原形排除，在体外评估寡核苷酸药物是否为肾脏转运体底物非常重要。

总体来说，目前缺乏小核酸药物相关的DDI指导原则，更为提倡像小分子药物一样，尽可能多的体外评估其DDI风险。如果申办方未对小核酸药物导致的药物-药物相互作用进行体外评估，则应给出充分的说明。

4.7 体外遗传毒性评估

就寡核苷酸自身性质而言，小核酸药物一般不会引起遗传毒性，且目前的药物均为阴性结果，但寡核苷酸安全工作组( OSWG) 遗传毒理委员会仍认为对于新的寡核苷酸药物有必要进行遗传毒性实验，因为修饰的单体可能从寡核苷酸代谢时释放出来并整合到DNA中，理论上会导致链终止、错误编码和/或错误复制或修复；另外，该委员会推荐选用 ICH S2( R1) 指导原则标准“组合 1”考察小核酸药物的遗传毒性，即2项体外实验（细菌回复突变实验，Bacterial Reverse Mutation Test，即Ames Test + 哺乳动物细胞染色体畸变实验，In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test，或小鼠淋巴瘤TK基因突变实验，TK Gene Mutation Test）与1项体内实验(体内微核实验或染色体畸变实验)

  由上可知，小核酸药物体外研究中多方面会用到细胞模型，比如靶细胞结合和摄取、内体逃逸效率评估及靶细胞效应评价等，因此，合适的细胞模型对于小核酸药物体外研究至关重要。需要注意的是，小核酸药物体外研究对于细胞模型提出了新的要求：

GalNAc-siRNA需要2-3周才能达到最大的RNAi反应；

常规2D培养的细胞其靶基因表达模式发生改变；

常规2D培养的原代肝细胞其ASGPR表达模式改变；

靶细胞效应评价：常规2D培养的细胞不能完全代表体内细胞的表型。

由此可见，常规2D培养的细胞无法完全满足小核酸药物研究的需要，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，现以人、猴、犬、大鼠及小鼠等多种属贴壁原代肝细胞和基质细胞为研究基础，开发出HepatoMax肝细胞共培养系统和HepatoCon培养基系统以及用于3D细胞模型，包括细胞球状体（Spheroids）和类器官（Organoids）培养的超低吸附培养板及基质胶、培养基等产品，旨在为广大科研工作者提供更为合适的小核酸药物体外研究细胞模型。

肝细胞共培养系统可以延长细胞培养时间，维持增强细胞活性，增加细胞表达量，是理想的siRNA介导的基因敲除研究模型，有助于阐明各研究领域的肝细胞机制以及新型RNA疗法的体外安全性和有效性研究。而细胞球状体（Spheroids）和类器官（Organoids）等3D细胞模型能够更加准确地模拟体内细胞环境和组织结构，可以体外长时间培养并保持基因稳定性，实现真实的细胞生物学功能，也是小核酸药物体外研究的理想的细胞模型。

综上所述，小核酸药物凭借其独特的优势及研发取得的多项突破性成果，已成为全球投资新风口和生物制药巨头的必争之地，将带来第三次药物研发浪潮。体外研究在小核酸药物研发过程中无比重要，IPHASE可提供完整的小核酸药物体外研究“一站式”解决方案产品，助力广大科研工作者在此次制药浪潮中“披荆斩棘，乘风破浪”！

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参考资料：

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[5] 药明康德，《药物代谢与动力学：前沿、策略与应用实例》。

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