关键词：肝微粒体，药物-药物相互作用（Drug-drug interaction, DDI），细胞色素P450酶（CytochromeP450，CYP450），时间依赖性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）

药物-药物相互作用（Drug-drug interaction, DDI）是临床上产生严重不良反应甚至死亡的主要原因之一，因此对DDI发生的可能性和严重性及其影响程度进行科学评估是十分必要的。细胞色素P450酶（CytochromeP450，CYP450）是体内重要的药物代谢酶，其介导的药物相互作用评估主要包括代谢表型研究、酶诱导作用评估及酶抑制作用评估。其中，药物对于CYP450酶的抑制作用可分为可逆性抑制（Reversible Inhibition）和时间依赖性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）。与可逆性抑制相比，TDI会带来更严重的用药安全问题，因此逐年受到监管机构及药物研发者的重视。本期文章主要介绍CYP酶介导的时间依赖性抑制作用评估。

一、CYP酶介导的时间依赖性抑制介绍

CYP酶介导的酶抑制是指某些化合物能抑制某种或部分CYP450代谢酶的活性，导致联合用药时一些药物出现代谢减慢、清除率降低及暴露量增加的现象，从而造成安全隐患。根据抑制的机制不同，药物对于CYP450酶的抑制作用可分为可逆性抑制（Reversible Inhibition）和时间依赖性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）。时间依赖性抑制又称不可逆性抑制（Irreversible Inhibition），一般是指候选药物经CYP酶的代谢产物以共价键与酶形成复合物，导致酶不可逆性失活，抑制剂对酶的抑制效应在除去抑制剂后不会即刻消失，而是呈现出时间依赖的特性。

与可逆性抑制相比，时间依赖抑制（TDI）的发生会带来更为严重的用药安全问题。联合用药的药物如果受到TDI的影响，可能会存在暴露量非线性增长、血药浓度大幅升高等后果，给患者带来严重的健康威胁。最著名的实例莫如抗高血压药米贝拉地尔（mibefradil），它是一种钙离子T和L通道阻滞剂，上市后出现了严重的不良反应。最终经研究发现，米贝拉地尔是一种时间依赖性的抑制剂，对CYP3A4产生不可逆性抑制，使联合用的其他药物血药浓度大幅升高，以致产生毒性，甚至造成患者死亡，也因如此，米贝拉地尔不得不从市场上退出。

由此可见，TDI所造成的影响不仅给患者带来严重的健康威胁，对制药企业也是巨大的挑战和威胁，因此逐年受到监管机构及药物研发者的重视。《药物相互作用研究技术指导原则（试行）》和ICH指导原则《M12：药物相互作用》中明确表示应进行在研药物对7种常规的CYP同工酶CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4 产生的可逆性抑制和时间依赖性抑制（Time-dependent inhibition，TDI）的体外试验评估。

二、时间依赖性抑制体外试验评估

一般采用人肝微粒体作为体外孵育系统进行在研药物对于CYP450酶的时间依赖性抑制评估研究。目前常规的TDI评估方法有Single-point法、IC50位移法（IC50 shift）和Kinact/Ki法。

【Single-point法】

试验设计：一个或两个试验浓度(通常1uM/10uM),一个探针底物浓度；+/-NADPH预孵育一个时间点；粗糙的评估，适合早期和高通量筛选。

评价参数：相对剩余活性（% Remaining activity=（% of NC(+NADPH）/% of NC(-NADPH）)×100

评价标准：相对剩余活性＜80%，提示有潜在的TDI风险

【IC50位移法（IC50 shift）】

试验设计：系列试验浓度，一个探针底物浓度，+/-NADPH预孵育30min，以测定得到的IC50值进行评估；相对精准的评估，可用于进行粗略的DDI预测。

评价参数：IC50位移=IC50（30min pre-incubation,-NADPH) /IC50（30min pre-incubation,+NADPH)

评价标准：IC50位移≥1.5，提示在研药物存在TDI。

【Kinact/Ki法】

试验设计：系列试验浓度，系列探针底物浓度，+/-NADPH预孵育多个时间点；精准的测定手段，可用于进行DDI的更精准预测。

评价参数：Kinact/Ki

评价标准：结合临床PK数据，计算R2值评价临床意义。

目前使用比较广泛的评估TDI效应的方法为IC50 位移法，即设置系列抑制剂浓度，在加和不加NADPH的情况下于37℃进行预孵育，预孵育时间一般为30 min（也可以设置0min预孵育组作为对照）；预孵育后，加入含有NADPH的探针底物溶液，终止反应后，测定孵育液中底物代谢产物的生成量，计算在0min预孵育和30min预孵育（加和不加NADPH情况下）IC50值，比较IC50位移倍数，从而评价抑制剂是否具有时间依赖性抑制作用。

三、IPHASE时间依赖性抑制试验数据分析

鉴于此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，采用IC50位移法验证不同抑制剂对人肝微粒体CYP3A4酶的时间依赖性抑制（TDI）作用。IPHASE技术人员将预孵育时间设定为0min和30min，抑制剂浓度分别设置为0μM、0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM。通过已知阳性底物睾酮被CYP3A4酶转化为特异性代谢产物6β-羟基睾酮，利用液相-串联质谱（LC-MS/MS）检测6β-羟基睾酮的生成量进一步用于计算 IC50值。以下为结果数据分析：

1. 抑制剂无TDI作用

如图所示，在30min预孵育后，NADPH（+）组的IC50=6.91μM，NADPH（-）组的IC50=8.76μM，IC50位移倍数=IC50(30 min princubation, -NADPH)/IC50(30 min princubation, +NADPH)=8.76/6.91=1.27 ＜1.5，且两者相较于0 min孵育组的IC50值没有明显变化，表明在研药物对于CYP3A4酶没有TDI作用。

2.抑制剂为NADPH依赖的TDI

此图可以明显看出，在30min预孵育后，NADPH（+）组的IC50曲线较NADPH（-）组和0min预孵育组有明显的左移，其IC50位移倍数=12.43/0.63=19.73＞1.5，但NADPH（-）组的IC50曲线和0min孵育组没有明显变化，说明在研药物对于CYP3A4酶具有NADPH依赖的TDI作用。

3. 抑制剂为无NADPH依赖的TDI

在实际操作中，可能会遇到这样一种情况：在30min预孵育后，NADPH（+）组的IC50曲线较NADPH（-）组并没有明显的左移，如上图所示，IC50位移倍数=0.76/0.56=1.35＜1.5，似乎可以得出抑制剂对于CYP3A4酶没有TDI作用的结论。但图中可以明显看到经过30min预孵育时间的NADPH（+）组和NADPH（-）组的IC50曲线较0min预孵育组的IC50曲线有明显的左移，说明抑制剂对于CYP3A4酶的抑制作用是呈时间依赖性的，但这种抑制作用并不依赖于NADPH，也就是说，在研药物对于CYP3A4酶具有无NADPH依赖的TDI作用。

4. 抑制剂为NADPH依赖的酶代谢

第十四届中国药理学会药物代谢专业委员会药物和化学异物代谢学术会议,中国药理学会药物代谢专业委员会,药物和化学异物代谢,化学异物代谢,药物异物代谢

某次试验结束后，试验人员在统计结果后发现，在30min预孵育后，NADPH（-）组的代谢情况和0min预孵育组的代谢情况基本一致，但NADPH（+）组的IC50曲线较0min预孵育组的IC50曲线发生了右移。针对这一“反常”情况，我们分析抑制剂对于CYP3A4酶是可逆性抑制作用，可以和底物与CYP3A4酶发生竞争性结合，并且在NADPH存在的情况下可能被微粒体中的某种酶代谢，其代谢产物并不会对CYP3A4酶产生抑制作用。抑制剂在NADPH存在的情况下经过30min预孵育后，其代谢量较0min预孵育组多，原药本身剩余量更少，对于CYP3A4酶的抑制作用较0min预孵育组弱，因此IC50值变大，其IC50曲线发生了右移。因此，我们判断，在该组试验中，抑制剂可能发生了NADPH依赖的酶代谢。

5. 抑制剂为非NADPH依赖的酶代谢

如图所示，在30min预孵育后，NADPH（-）组和NADPH（+）组的IC50曲线基本一致，但相比0min预孵育组的IC50曲线均发生了右移，该情况和上面第4种情况类似，抑制剂可能发生了酶代谢，但该代谢过程是不依赖于NADPH的。也就是说，在30min预孵育时，NADPH（-）组和NADPH（+）组的抑制剂均发生了酶代谢，且两组间的代谢情况相似。在整个试验过程中，30min预孵育组的抑制剂较0min预孵育组酶代谢增多，对于CYP3A4酶的抑制作用减弱，因此IC50值变大，其IC50曲线发生了右移。因此，我们判断，在该组试验中，抑制剂可能发生了非NADPH依赖的酶代谢。

四、IPHASE相关产品

药物相互作用是新药研发重要的评价标准，而CYP酶介导的时间依赖性抑制作用评估是药物相互作用评估重要的组成部分。鉴于此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，凭借先进的设备，专业的技术人员和多年研发的经验，开发出人、猴、犬、大鼠、小鼠、猪、兔等多个种属纯度高、活性好的肝微粒体产品，助力广大客户进行CYP酶介导的TDI及其他方向的研究。

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参考资料：

[1] 谢珊珊，王盼，郭建军，等. 细胞色素P450酶的时间依赖性抑制研究及其在新药研发中的作用[J]．中国新药与临床杂志，2013, 32(6): 419-425.

[2] ICH指导原则《M12：药物相互作用》. 2024.

[3] NMPA. 药物相互作用研究技术指导原则（试行）.2021.

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