关键词：去唾液酸糖蛋白受体 (asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc), GaINAc-siRNA,食蟹猴肝细胞，siRNA递送，肝细胞转染，肝细胞自由摄取，肝细胞递送，原代肝细胞，猴肝细胞，人肝细胞，Cynomolgus Monkey Hepatocytes(PCH), Human Primary Hepatocytes(PHH), Primary hepatocyte siRNA transfection，siRNA Galnac hepatocyte delivery，Hepatic Targeted Delivery

siRNA等小核酸药物通常需要借助递送系统以提高其递送效率和组织靶向性。GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）偶联修饰是当前最常用的siRNA递送系统，目前上市的siRNA药物绝大多数采用GalNAc修饰来完成细胞内siRNA递送。GalNAc是去唾液酸糖蛋白受体（Asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的配体，ASGPR在肝细胞的膜表面高度特异性表达，GaINAc-siRNA (siRNA Galnac hepatocyte delivery)偶联物通过特异性结合去唾液酸糖蛋白受体，在细胞内吞作用下，将siRNA从细胞表面转运至细胞中，从而实现肝细胞靶向递送(Primary hepatocyte siRNA transfection)。由此可见，肝细胞膜表面ASGPR的表达情况是影响GaINAc-siRNA (siRNA Galnac hepatocyte delivery)等小核酸药物进入细胞内发挥药效的重要因素之一。因此，在小核酸药物研发初期，对肝细胞膜表面ASGPR的表达情况进行检测是十分必要的，这对于体外评估小核酸药物肝细胞自由摄取、肝细胞转染等情况具有重要意义。

一、ASGPR简介

去唾液酸糖蛋白受体 (asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，又名肝凝集素(liver lectin)，最初由美国的两位科学家Gilbert Ashwell和Anatol Morell于1965年发现，因此也被称作“Ashwell-Morell 受体”。哺乳动物的ASGPR由分子量约为48 kDa的大亚基 H1和分子量约为40 kDa的小亚基H2 这两个不同基因编码的亚基组成，这两个亚基是彼此高度同源的糖蛋白，两个亚基都属于Ⅱ型跨膜蛋白，且在哺乳动物中两者含量的比例约为3:1，二者联合具有内吞作用。ASGPR的大小两个亚基又分别有不同的剪接异构体，如图1所示。

图1 H1和H2亚基不同的剪切异构体 （a）H2的剪切异构体 （b）H1的剪切异构体（来源：人体去唾液酸糖蛋白受体的检测）

ASGPR以极性方式表达于肝实质细胞正弦和基底外侧的细胞膜表面，除了肝细胞表面，ASGPR还会表达在一些肝外组织中，例如腹膜巨噬细胞，大鼠及人类睾丸，人类精子，人肠上皮细胞和甲状腺细胞。然而，ASGPR在肝细胞上的表达远远超过了身体其他部位所表达的ASGPR，一个肝细胞中平均高表达500,000个ASGPR。ASGPR能专一识别和结合末端带有半乳糖(Gal)残基或乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基的寡糖或寡糖蛋白,目前已见报导的ASGPR配体包括去唾液糖蛋白、乳糖酸(lactoBioni cacid, LA)、半乳糖化配体(galactosylated ligand,Gal)、无唾液酸胎球蛋白(AF)以及豆甾醇糖苷(soyBean-derived sterylglucoside,SG)等。其中，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）是与ASGPR结合能力最强的一种乳糖类似物。因此，可利用ASGPR的内吞机制及配体特性以实现药物的肝内靶向递送(Hepatic Targeted Delivery)。

二、ASGPR：GalNAc-siRNA偶联药物实现肝靶向递送(Hepatic Targeted Delivery)的关键靶点

 siRNA药物具有基因沉默效率高、高度特异性、靶点范围广、不良反应可控、可实现长效作用、合成方便等优点，是当前极具前途的小核酸药物。然而，siRNA药物通常不具备特定器官和组织的靶向性，难以单独成药。此外，siRNA的分子量较大，且带有负电荷，使其不能自由通过生物膜。因此，siRNA药物通常需要借助递送系统以提高递送效率和组织靶向性。

GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）是当前最常用的siRNA药物递送系统，目前上市的siRNA药物绝大多数采用GalNAc修饰来完成细胞内递送（表1）。正如上文中提到的，GalNAc是去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的高亲和力靶向配体，其与ASGPR的结合具有高度特异性，ASGPR是一种内吞性受体，在肝细胞膜表面高度特异性表达。通过ASGPR和网格蛋白介导的内吞作用，GalNAc能够有效地将siRNA药物从肝细胞表面转运至细胞质内部。随后，GalNAc-siRNA 偶联物与ASGPR分离，ASGPR回到细胞表面而GalNAc-siRNA偶联物进一步解离，释放出的游离siRNA在细胞质中沉默基因进而发挥药效。GalNAc-siRNA偶联物与ASGPR结合及细胞内递送过程如图2所示。

表1 上市siRNA药物一览

图2 GalNAc-siRNA偶联物与ASGPR结合及细胞内递送过程（来源：GalNAc-siRNA Conjugates: Leading the Way for Delivery of RNAi Therapeutics）

由此可见，ASGPR是GalNAc-siRNA偶联药物实现肝内靶向递送的关键靶点，其在肝细胞膜表面的表达情况是影响siRNA等小核酸药物进入细胞内发挥药效的重要因素之一。因此，在siRNA等小核酸药物研发初期，对肝细胞膜表面ASGPR的表达情况进行检测对于体外评估siRNA等药物肝细胞自由摄取和肝细胞转染等情况具有重要意义。

三、IPHASE 贴壁食蟹猴肝细胞Cynomolgus Monkey Hepatocytes(PCH)ASGPR靶点检测

鉴于此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，不断开拓创新，紧跟市场发展步伐，及时响应客户需求，对生产的贴壁食蟹猴肝细胞Cynomolgus Monkey Hepatocytes(PCH) ASGPR靶点表达情况进行检测，旨在为广大客户提供优质的siRNA药物体外研究模型。IPHASE技术人员以0.5 million cells/ml的细胞密度铺板于96孔板中，待细胞贴壁4h后检测ASGPR表达情况，结果显示IPHASE研发的食蟹猴肝细胞高表达ASGPR，说明IPHASE生产的食蟹猴原代肝细胞（Primary Hepatocytes）较好的保留了肝细胞表面膜上蛋白的表达，可满足客户的试验需求。

此外，IPHASE为满足不同客户的研究方向，以丰富的研发经验和技术体系，生产了多种属、多品系的原代肝细胞（Primary Hepatocytes）及相关辅助产品，如下表所示为部分产品，以助力广大客户的药物研发需求。

参考资料：

[1] Springer AD, Dowdy SF. GalNAc-siRNA Conjugates: Leading the Way for Delivery of RNAi Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2018;28(3):109-118.

[2] 施奇敏. 人体去唾液酸糖蛋白受体的检测[D]. 江南大学. 2019.

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