关键词：原代肝细胞，肝实质细胞，肝星状细胞，库普弗细胞，‌肝窦内皮细胞，肝内胆管上皮细胞，siRNA递送，肝细胞自由摄取，肝细胞转染，primary hepatocytes，Hepatic Stellate Cells, HSCs，Kupffer Cells，Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs，Intrahepatic biliary epithelial cells, IBEpiCs，siRNA delivery，Cellular Uptake，Hepatocyte siRNA transfection，ASGPR, GalNAc

肝脏（Liver）是药物代谢的重要器官，体外代谢模型多以肝脏为基础。其中，原代肝细胞作为一种肝脏体外模型，因具有较好的体外试验重现性，基本维持了肝脏的代谢功能，特别是较好的保留了与体内一致的酶水平，成为了体外药物试验的“金标准”，广泛应用于药物代谢与毒理学等研究中。原代肝细胞可分为肝实质细胞（primary hepatocytes）和肝非实质细胞，其中肝实质细胞是原代肝细胞中最主要的组成部分，约占肝脏细胞总数的70%。肝非实质细胞主要包括肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）、库普弗细胞（Kupffer Cells）、‌肝窦内皮细胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs）及肝内胆管上皮细胞（Intrahepatic biliary epithelial cells,IBEpiCs)。本文将简要介绍各原代肝细胞的特点及功能，以供参考。

01    原代肝细胞特点与功能

1    原代肝实质细胞 
原代肝实质细胞（primary hepatocytes）是从动物肝脏直接分离的细胞，是肝脏中最常见的细胞类型，约占肝脏细胞总数的70%。肝实质细胞负责代谢、解毒、合成蛋白质及胆汁分泌等核心生理功能，是肝脏的主要功能细胞。此外，肝实质细胞是高度分化的细胞，具有丰富的酶系及多种特异性功能。作为一种体外模型，原代肝实质细胞具有其它体外模型不可替代的优点：

① 与体内环境保持一致，酶量和辅助因子水平都是正常的生理浓度，可以在接近生理状态的的情况下研究药物的代谢和毒性；

② 较好保留和维持了肝细胞的完整形态和肝细胞体外代谢活性，真实反应了体内的代谢情况；

③ 无须担心动物实验的伦理问题，亦可减少动物实验所需要的的成本开支，实现了减少（Reduction）、替代（Replacement）、优化（Refinement）的3R伦理原则。

原代肝实质细胞被分离后，可进行贴壁培养和悬浮培养。悬浮培养的原代肝实质细胞在最开始的4h内细胞色素P450酶的活性和体内最为一致，随时间的延长而迅速下降，故仅适合短期的悬浮代谢应用，如药物摄取、代谢稳定性、代谢产物鉴定和代谢物谱研究等。贴壁培养的原代肝实质细胞有足够的时间从损伤中恢复过来，具有正常细胞的形态特征，应用范围相对较广，较常见的为细胞毒性研究、酶诱导研究、慢代谢药物的代谢稳定性、代谢产物鉴定等研究。

SD大鼠悬浮原代肝实质细胞

猫贴壁原代肝实质细胞

此外，肝实质细胞膜表面高度特异性表达去唾液酸糖蛋白受体 (asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，一个肝实质细胞中平均表达500,000个ASGPR。ASGPR与GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）具有很高的亲和力，而GalNAc是目前siRNA等小核酸药物最常用的递送系统，GaINAc-siRNA偶联物通过特异性结合ASGPR，在细胞内吞作用下，将siRNA从细胞表面转运至细胞中，从而实现肝细胞靶向递送。因此，肝实质细胞还常用于siRNA递送（siRNA delivery）、肝细胞自由摄取（Cellular Uptake）及肝细胞转染（Hepatocyte siRNA transfection）等试验。

2    原代肝非实质细胞

【肝星状细胞Hepatic Stellate Cells, HSCs】

肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）占肝脏固有细胞总数的15%，占非实质细胞的30%左右。HSC位于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells,SEC）和肝细胞。其形态不规则，呈梭形或多边形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。HSC胞质内有1～14个直径约1.0～2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴，胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。胞核形态不规则，由于脂滴的挤压，常致细胞核有一个或多个凹陷，核内可见1～2个核仁。

肝星状细胞 来源于网络

正常情况下肝星状细胞呈静息状态，它在肝脏中的生理功能主要是参与维生素A的代谢，储存脂肪，肝星状细胞的胞浆中含有类视黄醇物质的脂滴，是维生素A的主要储存处，肝星状细胞还有调节血管和肝窦血流的作用。此外，肝星状细胞可分泌R-spondin 3（RSPO3），通过WNT/β-catenin信号通路维持肝细胞代谢分区（如CYP450酶空间分布），保障解毒、糖脂代谢等功能。RSPO3的缺失将直接导致肝细胞代谢“地图”混乱，再生与修复能力失调。

当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静息型转变为激活型。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质（ECM）参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。这两类变化最终奠定了肝纤维化、门静脉高压症发病的病理学基础。

【库普弗细胞（Kupffer cell）】

库普弗细胞（Kupffer cell、Browicz-Kupffer cell、stellate macrophages，亦称为肝巨噬细胞）是位于肝脏中的特殊巨噬细胞，是单核吞噬细胞系统的一部分。库普弗细胞的发育来自骨髓，由前单核细胞（promonocytes）、原单核细胞（Monoblast）、单核细胞发育而来，血液中的单核细胞再进一步在肝窦壁发育成库普弗细胞。库普弗细胞可通过吞噬作用清除血循环中异物颗粒或红细胞。

库普弗细胞 来源于网络

库普弗细胞（Kupffer cell）的核心功能包括：

🔷 免疫防御

清除异物‌：通过吞噬作用清除血液中的病原体、抗原-抗体复合物及细胞碎片‌。

补体介导清除‌：表面CRIg受体可识别并清除补体结合的病原体，在先天免疫中起关键作用。‌

🔷 代谢调控

· 分解衰老红细胞，回收铁离子，并将胆红素转运至肝细胞处理，最终通过胆汁排出。‌

另外库普弗细胞表面存在着多种受体，可被多种配体激活，通过产生细胞因子、炎症介质和活性氧等，在多种肝细胞损伤的发病过程中起到重要的作用。

① 肝纤维化

活化的库普弗细胞通过释放促炎因子（如IL-6、TNF-α）和活性氧，加剧肝细胞损伤及纤维化进程，肝纤维化模型中可见库普弗细胞显著增生。

② 非酒精性脂肪肝病（NAFLD）

库普弗细胞通过调控氧化应激和炎症反应参与NAFLD发病，抑制其活化可有助于减轻或阻止非酒精性脂肪肝的发生和发展。‌‌

【肝窦内皮细胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs）】

肝窦内皮细胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs）是构成肝窦壁的主要非实质细胞，占肝脏细胞总数的15%-20%，具有独特的窗孔结构（直径100-150 nm），缺乏基底膜，直接与肝细胞接触，形成肝血窦与Disse腔的物质交换界面。 LSECs的窗孔数量和大小可随生理状态（如年龄、疾病、毒素暴露）动态变化。‌

‌肝窦内皮细胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs）的核心功能包括：

🔷 物质交换和代谢调控

·通过窗孔结构促进脂蛋白、代谢产物在血液与肝细胞间的双向运输，维持肝脏代谢稳态。

· 分泌一氧化氮（NO）调节肝窦血管张力，改善肝脏微循环。

🔷 免疫调节作用

· 作为抗原呈递细胞（APCs），LSECs通过MHC II类分子激活T细胞，诱导免疫耐受。

· 与Kupffer细胞协同清除病原体，并通过释放IL-10抑制过度炎症反应。

此外，‌肝窦内皮细胞在多种肝脏疾病的发病机制中扮演重要的角色：

① 肝纤维化

     慢性损伤导致LSECs窗孔减少并形成基底膜，激活肝星状细胞（HSCs）分泌ECM，促进肝纤维化‌。另外，LSECs可分泌TGF-β和PDGF，直接激活HSCs转化为肌成纤维细胞。‌

② 非酒精性脂肪肝病（NAFLD）

LSECs窗孔丢失导致脂蛋白滞留，加剧肝细胞脂质沉积和氧化应激‌。相关研究显示NAFLD患者中LSECs的促炎因子（如IL-6）表达显著升高，与疾病进展正相关。‌

【肝内胆管上皮细胞（Intrahepatic biliary epithelial cells,IBEpiCs】

肝内胆管上皮细胞（Intrahepatic biliary epithelial cells,IBEpiCs)是构成肝内胆管系统的主要功能细胞，分布于肝内二级胆管及其分支以上的胆管系统，主要覆盖肝左叶和右叶的胆管分叉处‌。细胞呈立方或柱状，紧密排列形成胆管腔，表面具有微绒毛以增加吸收面积。IBEpiC负责胆汁的分泌、修饰和运输，其功能与病理机制的研究对肝胆系统疾病的诊疗具有重要意义。

肝内胆管上皮细胞（Intrahepatic biliary epithelial cells,IBEpiCs)的核心功能包括：

① 胆汁分泌与修饰：分泌碳酸氢盐和水分，调节胆汁酸碱度（pH 7.6-8.6），促进脂质消化。

② 物质转运：通过离子通道（如CFTR氯离子通道）和转运蛋白调控电解质平衡。

③ 免疫屏障：分泌IgA和黏蛋白（MUC5AC），抵御病原体入侵胆管系统。

  此外，肝内胆管上皮细胞在肝胆系统相关疾病的病例过程中具有重要作用：

① 原发性硬化性胆管炎（PSC）：慢性炎症影响肝内胆管上皮细胞功能，导致胆管纤维化狭窄，与免疫异常（如Th17细胞活化）相关。

② 肝内胆管癌（ICC）：占肝癌的10%-15%，危险因素包括肝吸虫感染、胆管结石，常见驱动基因突变（KRAS、IDH1/2、FGFR2融合）。这类肿瘤起源于胆管上皮细胞而非肝细胞‌，与肝细胞癌（HCC）相比，ICC在组织学起源（胆管上皮细胞）和临床表现（如早期症状隐匿、晚期易转移）上存在显著差异‌。

综上所述，肝脏是人体代谢、解毒和免疫的核心器官，其功能依赖于‌肝实质细胞（primary hepatocytes）、肝星状细胞（HSCs）、库普弗细胞（KCs）、肝窦内皮细胞（LSECs）及肝内胆管上皮细胞（IBEpiCs）等多种细胞的协同作用。研究这些关键细胞类型的意义不仅在于揭示肝脏生理机制，更对疾病诊疗、再生医学和药物开发具有深远影响。

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