Ames试剂盒（细菌回复突变试验试剂盒）

2022-01-20

Ames试剂盒是公司自主研发的一体化试剂盒产品，内含有Ames试验所需的全部鼠伤寒沙门氏菌株（TA97、TA98、TA100、TA102/WP2uvrApKM101菌株和TA1535）及培养基、组氨酸生物素、S9等试剂。本试剂盒中菌株及诱导S9加入保护剂后于-80℃保存，经复溶后可直接使用，省去了诱导S9的制备、菌株鉴定和活化培养等时步骤和时间。

Ames试剂盒4菌版（TA97a、TA98、TA100、WP2uvrApKM101、TA1535）

Ames试剂盒5菌版（TA97a、TA98、TA100、WP2uvrApKM101、TA1535）

Ames预实验试剂盒（TA97a/TA98，TA100）

Ames菌株鉴定试剂盒

微量波动Ames试验（Mini-Ames）试剂盒

试剂盒应用范围：
①化合物早期毒性筛选，早期毒性研究
②药品，食品，化学品，医疗器械，化妆品等的遗传毒性试验

试剂盒优势
传统试验
周期长：培养基成分准备、诱导S9制备、菌株鉴定、菌株培养等耗费大量时间。
稳定性差：杂菌污染、活菌数不符合要求、实验试剂配置不准确都会导致实验失败。

Ames试剂盒
便捷：省去培养基成分准备、诱导S9制备、菌株鉴定、菌株培养等时间，可直接使用，大大缩短试验周期。
准确：本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，菌株特性与活菌数目以及诱导S9活性均符合Ames试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。
稳定：本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。
 

Ames试剂盒产品手册

Ames 实验概述
沙门氏菌回复突变试验（亦称 Ames试验）于 1975年建立并不断发展完善，目前已被世界各国广为采用，已经成为毒理学实验室必需开展的重要实验项目。Ames实验用于检测待分析物质的致突变作用，该验灵敏、高效、检测范围广。

Ames 实验原理
Ames 试验利用鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株，该缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌诱导回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的 S9混合液。

1. 诱导 S9 采用国际先进无菌冻干干燥工艺制成，实现了诱导 S9 酶活性的稳定保存，同时有效防止了细菌污染。实验时用 S9 反 应液溶解混匀。   
2. 实验菌株采用先进工艺规模化制备，出厂前经过严格的质量检测，低温贮存条件确保了实验菌株的长期稳定性。实验时混 匀后即可直接使用，节省了菌株鉴定、活化处理以及菌液浓度调整等时间。     
3. 实验阳性对照试剂种类覆盖整个 Ames 实验要求，在添加和不添加 S9 的情况下均可以诱导实验菌株呈现阳性反应。阳性对照 试剂采购自国际大品牌公司，按照 Ames 实验需求精准定量分 装，出厂前经过实验检测，阳性对照试剂的长期稳定性有质量 保证。
4. 底层培养基 VS、GS 以干粉形式提供，便于培养基长期稳定 保存。使用前只需添加蒸馏水灭菌处理即可，试剂瓶采用耐高 温材料，因此可以直接向试剂瓶中添加所需剂量的蒸馏水。
5. 顶层培养基 HB 冻干球采用先进无菌冻干干燥工艺制成，使 用前需先用灭菌蒸馏水溶解，然后用 0.22μm 滤膜过滤除菌。

试剂盒应用范围 本试剂盒应用范围非常广，可进行食品与饮用水、化学品、洗涤剂、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装 材料等遗传毒理学检测。

传统实验操作不足
周期长——培养基成分准备、诱导 S9 制备、菌株鉴定、菌株培养 等耗费大量时间。 稳定性差——杂菌污染、活菌数不符合要求、实验试剂配制不准 确等都会导致实验失败。

试剂盒优势
便捷—— 本试剂盒省去了培养基成分准备、诱导 S9 制备、菌株 鉴定、菌株培养等时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。 准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染， 菌株特性与活菌数目以及诱导 S9 活性均符合 Ames 试验要求，实 验结果准确、可靠、重现性高。
稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。

试剂盒使用操作流程
1. 实验器材、试剂准备：三角瓶、5mL 或 15mL 试管、100μl 和1000μl 枪头、0.22μm 滤膜、注射器、平皿、二甲基亚砜、灭菌 蒸馏水等；
2. 设置待测物剂量，配制各剂量无菌待测物溶液；
3. VS、GS 培养基加水溶解并灭菌，配制底层培养基；
4. HB 球加灭菌蒸馏水溶解，充分混匀，然后过滤除菌；
5. 实验当天配制顶层培养基，2ml 分装，然后 45℃水浴保温；
6. 用无菌蒸馏水溶解 S9 复合物并配制 S9 反应混合液；
7. 开展 Ames 实验，将 2mL 顶层培养基+100μL 菌液+100μL 待测 物或阳性底物+500μL10% S9 混合液混匀，倾倒于底层培养基（实验室温度低时倾倒的顶层培养基易冷凝，可将底层培养基 放置于 37℃培养箱一段时间，然后再倾倒顶层培养基）；
8. 待顶层培养基冷凝后，将实验平皿放入 37℃培养箱，培养 48h后观察实验结果；

试验方法  试验方法主要是平板掺入法和预培养平板掺入法，具体操作如下：

1. 平板掺入法
a) 准备所需底层培养基平皿若干。
b) 融化顶层培养基分装于无菌小试管，每管2 mL，在45℃水 浴中保温。
c) 在保温的顶层培养基中依次加入测试菌株菌液0.1 mL，混 匀；加受试物0.05 mL~ 0.2 mL（一般加入0.1 mL。需活化时 另外再加入10 % S9反应混合液 0.5 mL），再混匀，然后迅 速倾入底层培养基上。转动平皿，使顶层培养基均匀分布 在底层上，平放固化，37℃ 培养 48 h观察结果。
d) 另做一阳性对照、溶剂对照和未处理对照。阳性对照不加 受试物，只加标准诱变剂（即试剂盒阳性对照试剂，见表2）；溶剂对照加除受试物和标准诱变剂以外的所有试剂， 如溶剂二甲基亚砜等（光谱纯或分析纯）；未处理对照只 在培养基上加菌液；其他方法同上。
2. 预培养平板掺入法 预培养对于某些受试物可取得较好效果。因此可根据情况确定 是否进行预培养。在加入顶层琼脂前，先进行以下预培养步
骤：在试验中，将受试物（需活化时另加入10% S9反应混合 液）和菌液，在37℃中培养20min，或在30℃中培养30min，然 后再加2mL顶层琼脂，其他同上述平板掺入法。

试验设计及受试物的特殊处理
1) 剂量设计 决定受试物最高剂量的原则是受试物对试验菌株的毒性和受试物的溶解度。对于纯的化学物质，一般最低剂量为每平皿0.2 μg，最高剂量为 5 mg，或溶解度允许，或饱和浓度，或对细菌产生最小毒性浓度。对于毒性很低、摄入量很大的定型产品，可根据其溶解度和对细菌的毒性采用可能的最大剂量。每 种受试物在允许最高剂量下设4个（含4个）以上剂量，每剂量间隔不超过5倍，每个剂量应做三个平皿。
2) 溶剂 溶剂可选用水、二甲基亚砜或其他溶剂（溶剂剂量应限定在毒性剂量以下。以二甲基亚砜为例，平板掺入法每皿不超过0.1mL 溶剂；预培养平板掺入法每皿不超过0.01mL 溶剂）， 无论选用什么溶剂均应无诱变性。
3) 对照组的设置 试验应同时设有阳性物对照组、溶剂对照组和未处理对照，均 包括加S9和不加S9两种情况。
4) 受试物的特殊处理 若遇特殊受试物作非常规处理时应在报告中说明。对以下几种情况可作如下处理：
a)  含组氨酸受试物：根据食品中测得的组氨酸含量若能诱发 回复突变率的增高可加设组氨酸平行对照组；或将检品经XAD-II树脂柱过滤洗脱预处理。
b)  食品包装材料及其制品成分：根据材料或制品的组成成 分，可分别采取过筛抽提、蒸发残渣等技术处理。
c)  挥发性受试物：可采用真空干燥器处理等方法。
d)  天然植物材料：可按植物化学方法制备粗制品或纯制品。

结果的判定 以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而定，如在背景生 长良好条件下，受试物组回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的 两倍或两倍以上，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重 复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物诱变试验 阳性。受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验菌 株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物对 鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受试物经四个试验菌株检 测后，无论加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受试物为致突 变阴性。

Ames 实验报道文献举例
       广东省疾病预防控制中心通过 Ames 试验发现部分染发剂引起试验 菌株 TA97、TA98、TA100 回变率明显升高，提示部分染发类 产品具有致突变作用，可对健康产生危害。何冬梅等、中 国 卫 生检验杂志 2007,17,(11)。
       人参与女贞子是临床上常见的有一定抗肿瘤效果的补益中药，在 Ames 试验中人参能抑制二氨基芴引起的 TA98 菌株回变菌落数的增加；女贞子能抑制叠氮钠引起的 TA100 菌株回变菌落数的增加，分别表现出抗移码型突变和抗碱基置换型突变的作用。倪娅等、中国保健 2009,17,(17)。生活饮用水经投加二氧化氯处理后对水中石油类污染物具有较 强的去除作用，可使水中有毒有害有致癌性的物质氧化降解为 毒性较小、无致癌作用的小分子物质，并且致突变活性明显降低，Ames 值由阳性转为阴性。高庆然等、工业用水与废水2001,6。

       喹烯酮是我国自主研发的喹噁啉类一类新兽药，作为抗菌促生 长剂用于猪饲料中， Ames 试验表明喹烯酮对 TA97、TA98、 TA100 和 TA1537 加和不加 S9 在一定剂量下均为阳性。结果提 示，喹烯酮存在一定致突变毒性，应制定最高残留限量。张伟 等、毒理学杂志 2007,04。

       Ames 试验表明煤和液化石油气（LPG）燃烧颗粒物均具有很强 的直接和间接致突变作用，主要致突变作用来源于硝基和胺基多环芳烃，两种颗粒物同时存在可加大致癌风险。闫洪涛等、 中国公共卫生 2007,04。

       烷基酚聚氧乙烯醚（APES） 是一大类表面活性剂家族，广泛 用于家庭和工业的清洁产品，烷基酚类化合物是其降解产物， 其中对甲基苯酚、2,6-二甲基苯酚、4-乙基苯酚、4-辛基苯酚、对壬基苯酚、4-硝基苯酚、2-氯苯酚、1,3-二氯苯酚、2,4-二氯 苯酚、2,6-二氯苯酚、三氯苯酚和 2,3,5,6-四氯苯酚 12 种化合物 的 Ames 试验表明除 2,4- 二氯苯酚未诱发各菌株的阳性反应外，其余 11 种待测物均诱发了阳性反应,说明这 11 种苯酚类化 合物均具有致突变性。杨丽等、东北师大学报（自然科学版）
2003,01。

       重组葡糖激酶作为一种生物技术药物具有明显的溶栓和抗凝效果，Ames 实验结果显示重组葡糖激酶对试验菌株 TA97 、TA98、TA100 和 TA102 无诱发回变作用。刘永学等、癌变·畸变·突变 2004,9。

常见问题及原因分析
1、自发回变数显著低于标准 原因：a. 试剂盒保存条件不合适，菌株失活或营养成分降解；b.培养基配制操作过程中组氨酸、生物素添加量低；c.操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高；
2、自发回变数显著高于标准 原因：a. 培养基配制操作过程中组氨酸、生物素添加量高；b.培养皿经环氧乙烷消毒不彻底或环氧乙烷有残留；
3、阳性底物诱变菌落数偏离标准范围 原因：a. 阳性底物溶解不彻底或未充分混匀；b. 阳性底物添加量不准确；c. 试剂盒保存条件不合适或过期，阳性底物降解或 S9失活；d. 操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高；
4、待测物诱变菌落数非常低或没有菌落 原因：a. 待测物或待测物溶剂对细菌生长有毒性；b. 试剂盒保存条件不合适或过期，阳性底物降解或 S9 失活； c. 操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高；
5、菌落分布不均匀，集中偏向一侧。原因： 倒底层或顶层培养基时平皿未水平放置；
6、顶层或底层培养基凝固不充分或滑出平皿 原因：a. 顶层或底层培养基中琼脂粉含量低；b. 顶层培养基中加入的溶剂或待测物酸化，导致凝胶不充分；

7、如何判断 Ames 实验结果是否为假阳性 将经受试物和阳性对照物处理的 Ames 菌落进行增菌培养后接种于无组氨酸的培养基上,观察比较细菌的生长情况。如果经受试 物处理的菌株不能生长在无组氨酸的培养基中,而经阳性对照物处 理的菌株则可以生长在无组氨酸的培养基上,则说明经受试物处理 的菌株没有发生突变，试验中所观察到的菌落数增加是假阳性。

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