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体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验原理及注意事项

2021-10-15

体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验原理及注意事项

2021-10-15

体外哺乳类细胞基因突变（HGPRT）试验原理及注意事项

In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test

【试验原理】
体外哺乳动物细胞基因突变试验是利用培养的哺乳动物细胞作指示生物的体外遗传毒理学试验，可用于检测有化学物质诱导的基因突变，适用的细胞系包括小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y），中国仓鼠肺细胞（V79），中国仓鼠卵巢细胞（CHO），人类淋巴母细胞（TK6）等。这些细胞系，常用的遗传学终点是检测胸苷激酶（TK）图标，次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶（HPRT/HGPRT）图标，黄嘌呤转磷酸核糖激酶（XPRT）基因突变。TK、HPRT/HGPRT、XPRT突变试验可以检测不同的遗传事件谱。
细胞在正常情况下，能产生HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine,6-TG）的选择性培养液中，HGPRT催化产生核苷-5^，-单磷酸（NMP），NMP掺入DNA中致细胞死亡。在致癌和（或）致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制HGPRT的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用，能够在含有6-TG的选择性培养液中存活生长。在有或无代谢活化系统的条件下，将细胞培养物暴露于受试物中适当时间，然后将细胞再传代培养，在含有6-TG的选择性培养液中，突变细胞会继续分裂并形成集落，计数突变集落形成数，计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。
【参考标准】
GB 15193.12-2014 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验
【材料和试剂】
细胞：常用中国仓鼠肺细胞株（V79）和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），其他如小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）和人类淋巴母细胞株（TK6）亦可。细胞在使用前应进行有无支原体污染的检查。
培养液：应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。对于 V79和 CHO 细胞，常用最-低必需培养基（MEM，Eagle）、改良 Eagle培养基（DMEM）加人10%胎牛血清和适量抗菌素。对于 TK6 和 L5178Y细胞，常用 RPMI 1640培养液，加人10%马血清（培养瓶培养）或20%马血清（96孔板培养）和适量抗菌素（青霉素、链霉素）。
胰蛋白酶/EDTA溶液：用无钙、镁 PBS配制，胰酶的浓度为0.05 %，EDTA 的浓度为0.02% ,胰蛋白酶与EDTA溶液按1:1混合。-20℃储存。
活化系统：通常使用的是S9混合物。
选择剂：6-硫代鸟嘌呤(6-TG)，建议使用终浓度为5μg/mL～15μg/mL,用碳酸氢钠溶液(0.5 %)配制。
预处理培养液(THMG/THG)：为减少细胞的自发突变频率，在试验前，先将细胞加在含 THMG的培养液中培养24h，清除自发的突变细胞，然后再将细胞接种于THG(不含氨甲喋呤的THMG培养液)中培养1d～3d至细胞恢复正常生长周期和形态。
THMG 所含各物质终浓度如下(除培养液成分外):
————胸苷，5×10^-6 mol/L；
————次黄嘌呤，5×10^-5 mol/L；
————氨甲喋呤，4×10^-7 mol/L；
————甘氨酸，1×10^-4 mol/L；
【试验方法】
一、受试物
受试物配制：固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。受试物应在使用前现用现配，否则就必须证实贮存不影响其稳定性。
溶媒的选择：溶媒必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首-选溶媒是蒸馏水；对于不溶于水的受试物可选择其他溶媒，首-选二甲基亚矾(DMSO)，但使用时浓度不应大于0.5%。
对照：
每一项试验中，在有无代谢活化系统条件下均应设阳性和阴性(溶媒)对照组。

阳性对照：当使用代谢活化系统时,阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质，可以使用3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene)、N-亚硝基二甲-胺(N-nitroso-dimethylamine)、7,12-二甲基苯并[a]蒽(7, 12-dimethylbenz[a]anthracene)等。在没有代谢活化系统时,阳性对照物可使用甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate)、乙基亚-硝基-脲(ethylnitrosourea)等。也可使用其他适宜的阳性对照物。
阴性对照：阴性对照(包括溶媒对照)除不含受试物外，其他处理应与受试物相同。此外，当不具有实验室历史资料证实所用溶媒无致突变作用和无其他有害作用时，还应设空白对照。

二、剂量
最-高浓度选择：决定最-高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH 或渗透压的改变。
细胞毒性确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在代谢活化系统存在和不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对存活率。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。
浓度设置和最-高浓度选择：至少应设置4个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性，通常浓度间隔系数在2～√10之间；如最-高浓度是基于细胞毒性，那么该浓度组的细胞相对集落形成率或相对存活率应为 10%～20 %(不低于10% )。对于那些细胞毒性很低的化合物，最-高浓度应是5μL/mL、5mg/mL或0.01mol/L。对于相对不溶解的物质，其最-高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值；最-好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S9等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化，不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察。
三、试验步骤和观察指标
贴壁生长细胞的试验步骤和观察指标：

细胞准备：将5×10⁵个细胞接种于直径为10 mm平皿中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养24h。
接触受试物：吸去培养液，PBS洗两次，加人一定量的无血清培养液、一定浓度的受试物及S9混合物(无需代谢活化者用无血清培养液补足），置于培养箱中3h～6h，结束后吸去含受试物的培养液，用 PBS洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养19h～22 h。
表达：接触受试物的细胞继续培养19h～22 h后用胰酶-EDTA 消化，待细胞脱落后，加入含10%血清的培养液终止消化，混匀，放入离心管以800r/min～1000r/min的速度离心5min～7min，弃上清液，制成细胞悬液，计数，以5×10⁵ 个细胞接种于直径为10 mm 的平皿，3d后传代，仍接种5×10⁵个细胞培养3d（最-佳表达时间为6d～8d）。
细胞毒性测定：将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37℃、5二氧化碳条件下培养7d，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数。
突变体的选择及集落形成率的测定：表达结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿接种200个细胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算集落形成率。同时另做突变频率测定，每组5个皿，每皿接种2×10⁵个细胞，待细胞贴壁后加人6-TG（建议使用终浓度为5μg/mL～10μg/mL），放人培养箱培养8d～10d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，并计算突变频率。

悬浮生长细胞的试验步骤和观察指标：

细胞准备及接触受试物：取生长良好的细胞，调整密度为5×10⁵/mL，按1%体积加入一定浓度的受试物及S9混合物（无需代谢活化者用无血清培养液补足），37 ℃振摇处理3h～6h，以800r/min～1000r/min的速度离心4min～6min，弃上清液，用PBS或无血清培养液洗细胞2次，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中，并调整细胞密度为2×10⁵/mL。
PE₀（0天的平板接种效率）测定：取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6个细胞/孔），每个剂量接种1～2块平板，37℃，5 二氧化碳，饱和湿度条件下培养9d～11d，计数每块平板有集落生长的孔数。
表达：取上一步所得细胞悬液，作6d表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在1×10⁶/mL以下。
PE₆（第六天的平板接种效率）测定：表达培养结束后，取适量细胞悬液，按PE₀（0天的平板接种效率）测定方法测定PE₆。
突变频率（MF）测定：表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁵/mL，加人6-TG（建议使用终浓度为5μg/mL～15μg/mL），混匀，接种96孔板（每孔加0.2mL，即2×10⁴个细胞/孔），每个剂量接种2～4块平板，37℃，5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养11d～14d，计数有突变集落生长的孔数。

【数据处理和结果评价】

数据处理

贴壁生长细胞 HGPRT试验数据处理：
细胞毒性：以相对于溶媒对照组的集落形成率表示细胞毒性。即以溶媒对照的集落形成率为100%(1.00),求出各受试物组的相对值。

集落形成率和突变频率：

悬浮生长细胞 HGPRT试验数据处理：

平板接种效率(PE₀、PE₆)：

相对存活率（RS）：

突变频率（MF）：

结果评价：
阳性结果的判定：

受试物组在任何一个剂量条件下的突变频率为阴性（溶媒）对照组的3倍或3倍以上，可判定为阳性。
受试物组的突变频率增加，与阴性（溶媒）对照组比较具有统计学意义，并有剂量-反应趋势，则可判定为阳性。
受试物组在任何一个剂量条件下引起具有统计学意义的增加并有可重复性，则可判定为阳性。

阴性结果的判定：

不符合上述阳性结果判定标准，则可判定为阴性。
【试验报告】

试验名称、试验单位名称和联系-方式、报告编号。
试验委托单位名称和联系-方式、样品受理日期。
试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。
试验摘要。
受试物：名称、鉴定资料、CAS编号（如已知）、纯度、与本试验有关的受试物的物理和化学性质及稳定性等。
溶媒和载体：溶媒和载体的选择依据，受试物在溶媒和载体中的溶解性和稳定性。
细胞株：名称、来源、浓度及培养条件（包括培养基的组成、培养温度、CO₂浓度和培养时间）。
试验条件：剂量、代谢活化系统、标准诱变剂、操作步骤等。
试验结果：各剂量组受试物（加和不加S9）对细胞的毒性和突变频率的均数和标准差、是否具有剂量-反应关系、统计结果，同时进行的阴性（溶媒）对照和阳性对照的均数和标准差、以及阴性（溶媒）对照和阳性对照的历史范围。

结论：本试验条件下受试物是否具有致突变作用。
【试验解释】
若阴性对照中，集落形成率或存活率低于50%，结果应不采用。各实验室选用的阳性对照突变频率有一定范围，若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下限以上，否则结果不能成立。
HGPRT基因突变试剂盒
北京汇智泰康针对体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验开发HGPRT基因突变试剂盒，试剂盒提供了进行体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验所需的主要试剂和细胞(V79)，可用于评价受试物的致突变作用。所用细胞和试剂均符合国标GB 15193.12-2014 《食品安全-国家标准体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验》的要求。
20mL×24体系/盒，4个剂量组。

【产品使用说明】
1、细胞复苏
收到试剂盒后，请尽快复苏细胞。
从-70℃冰箱中取出细胞，于37℃水浴融化，离心，弃上清，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基重悬；再次离心，弃上清，用10% FBS培养基，接种于细胞培养瓶中，放置于37℃的二氧化碳培养箱中培养，后期细胞传代比例为1:3。
2、自发突变细胞清除
取对数生长期细胞悬液，于含1% （V/V）的THMG的培养液中培养24 h，离心，洗涤后将细胞接种于含1% （V/V）的THG（不含氨甲喋呤）培养液中继续培养1d~3d，至细胞恢复正常生长周期和形态。
注：为确保试验的可行性，试验中所用细胞的自发突变率应在5×10^-6~20×10^-6之间，清除自发突变的细胞传代使用不得超过1个月，且每次试验前需将细胞清除自发突变。
3、染毒处理
将5×10⁵个细胞接种于直径为100mm的平皿中，于37℃，5%二氧化碳培养箱中放置培养24h。吸去培养液，PBS洗两次，加入一定量的无血清培养液、一定浓度的受试物及10%S9混合液（无需代谢活化者用无血清培养液或S9反应液PS补足），置于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养3~6h，结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养19~22h，每个试验组平行处理两份培养物。
（1）S9混合液及染毒用细胞液配制

注：在试验过程中，需根据实际需求，调整配制量。
（2）推荐染毒培养体系配制方案（试剂盒仅提供1次完整实验的4个剂量组所需）

注：1.染毒时间可根据实际情况进行调整，一般为3h~6h，必要时可延长到1个或多个细胞周期。
2.如进行短时间染毒，可直接加入稀释并混合均匀的丝裂-霉素C；若进行24h染毒，则需将丝裂-霉素C再稀释2.5倍后再加入。
4、表达培养
接触受试物的细胞继续培养19~22h后，用胰酶-EDTA消化，待细胞脱落后，加入含10%血清的培养液终止消化，混匀，放入离心管中800r/min~1000r/min的速度离心5~7min，弃上清液，制成细胞悬液，计数，以5×10⁵个接种于直径为100mm的平皿，3d后传代，仍接种5×10⁵个细胞培养3d（最-佳表达时间为6d~8d）。
5、细胞毒性测定
将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37℃、5%的二氧化碳条件下培养7d，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数。
以相对于溶媒对照组的集落形成率表示细胞毒性，即以溶媒对照的集落形成率为100%，求出各受试物组的相对值。计算公式见（1）：
A=B/C×100%------------------------------------------（1）
式中：A—相对集落形成率，%；B—受试物组集落形成率，%；C—溶媒对照组集落形成率，%。
6、突变体的选择和集落形成率的测定
表达培养结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿接种200个细胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算集落形成率。同时另做突变频率测定，每组5个皿，每皿接种2×10⁵个细胞，待细胞贴壁后，按照千分之一的比例加入6-TG，放入培养箱中培养8~10d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算突变频率。
集落形成率计算见式（2）：
D=E/F×100%-------------------------------------------（2）
式中：D—集落形成率，%；E—实际存活的细胞集落数；F—接种细胞数。
突变频率计算见式（3）：

式中：G—突变频率；H—突变集落数；I—接种细胞数；D—集落形成率。
7、结果评价
7.1 实验成立条件
若阴性对照中，集落形成率低于50%，结果应不予采用。
若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下线以上，否则结果不成立。
7.2 结果判定
受试物组在任何一个剂量下的突变频率为阴性（溶媒）对照组的3倍或3倍以上，可判定为阳性。
受试物组的突变频率增加，与阴性（溶媒）对照组比较具有统计学意义，并有剂量-反应趋势，则可判定为阳性。
受试物组在任何一个剂量条件下引起具有统计学意义的增加并有可重复性，则可判定为阳性。
不符合上述阳性结果判定标准，则可判定为阴性。
【注意事项】
实验前请自行准备胎牛血清、RPMI1640基础培养液、胰酶-EDTA、Giemsa染色液、100mm平皿、灭菌枪头、无菌移液管、二氧化碳培养箱、振荡器、50mL离心管等，所有耗材需做无菌处理。