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体外DMPK研究-药物Ⅰ相代谢稳定性研究方法及数据分析

2025-02-27

关键词：Phase Ⅰ Metabolism，Metabolic Stability，CytochromeP450，CYP450，Liver microsomes，Primary hepatocytes

药物代谢又称生物转化(biotransformation)，是指药物被机体吸收后，在体内各种酶以及体液环境作用下发生化学结构的改变的过程。药物在体内的生物转化可分为Ⅰ相代谢反应（Phase Ⅰ Metabolism）和Ⅱ相代谢反应（Phase Ⅱ Metabolism），两种类型的反应都得到极性更强、水溶性更好的产物，因此它们更易通过胆汁和尿被排泄出体外。代谢稳定性（Metabolic Stability）反映了化合物对生物转化的敏感性，它会影响化合物的口服生物利用度以及体内半衰期，进而影响到化合物在体内的安全性和有效性。因此，在药物研发初期，有必要对药物的代谢稳定性情况进行考察。与体内代谢稳定性研究相比，药物体外代谢稳定性研究可排除体内诸多干扰因素的影响，有助于更直接地观察药物的代谢特征，具有省时、稳定、高效的特点，可用于候选药物的高通量筛选。本文简要介绍药物体外Ⅰ相代谢稳定性体外研究方法及数据分析，以供参考。

一、药物Ⅰ相代谢介绍

药物Ⅰ相代谢（Phase Ⅰ Metabolism）是指药物分子上引入新的基团或除去原有小基团的官能团反应，包括氧化、还原和水解等反应。Ⅰ相代谢反应中最重要的酶系是细胞色素P450（CytochromeP450，CYP450），属于单加氧酶（momooxygenase），主要存在于滑面内质网的微粒体中，能催化烷烃、烯烃、芳烃和类固醇等多种物质进行氧化反应。该酶系由细胞色素P450和NADPH-细胞色素P450还原酶（以FAD为辅基的黄素蛋白）偶合组成，需要分子氧和还原辅酶Ⅱ（NADPH）参与反应，催化基本反应为：

单加氧酶能直接激活氧分子，使其中一个氧原子直接加入底物分子中形成羟化物或环氧化物，另一个氧原子则被NADPH还原为水。由于一个氧分子发挥了两种功能，故单加氧酶系又称为混合功能氧化酶；又因底物的氧化产物是羟化物，所以又称为羟化酶。单加氧酶的反应过程见图1：

图1 单加氧酶的反应过程

此外，参与Ⅰ相代谢过程还原反应的酶主要有硝基还原酶和偶氮还原酶，能使硝基化合物和偶氮化合物还原生成胺类；参与水解反应的酶包括酯酶、酰胺酶、糖苷酶等，可分别催化酯类、酰胺类、糖苷类化合物的水解以降低或消除其生物活性。

由此可见，Ⅰ相代谢是药物代谢的重要环节，通过Ⅰ相代谢反应，药物分子的化学结构会发生变化，例如引入或暴露某些官能团（如羟基、氨基等）。这些结构改变会使药物的性质产生变化，影响其药理活性、毒性以及药代动力学特征等。它在药物研发、药物疗效和安全性评估等方面都有着关键意义，如果药物的Ⅰ相代谢稳定性较差，可能导致在体内过快或过慢地代谢，从而影响药物的有效性和安全性。因此，了解待测化合物的Ⅰ相代谢稳定性对于选择具有良好药代动力学特征的候选药物至关重要。

二、药物Ⅰ相代谢稳定性体外研究方法

由于肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，富含参与药物Ⅰ相代谢反应的各种酶，因此，药物体外代谢稳定性研究多以肝脏为模型。较常使用的肝脏体外代谢模型有肝微粒体（Liver microsomes）和原代肝细胞（Primary hepatocytes）等。

（1）肝微粒体体外温孵法试验方法

肝微粒体中包含了大部分Ⅰ相代谢酶，其中最重要的是以CYP450为主要成分的微粒体混合功能氧化酶系统，在用肝微粒体进行研究时，如加入相应的辅助因子NADPH，则可重组体外代谢体系，从而通过体外温孵法进行Ⅰ相代谢稳定性研究。

① 样本准备：肝微粒体（人、猴、犬、大鼠、小鼠等种属），试验体系中微粒体蛋白终浓度建议是在0.1mg/mL-1mg/mL之间；待测药物终浓度一般为1μM，不建议过高。

② 温孵反应：将肝微粒体、测试药物溶液以及NADPH再生系统混合于合适的反应容器（如小型离心管）中。通常反应体系的体积在200-500μL左右。将反应容器置于37°C环境中孵育一定时间，如0，5，10，15，30，60 min。每个样品平行3次，同时需设置空白对照组、阴性对照组和阳性对照组。

③ 终止反应与样本处理：孵育结束后，可通过加入有机溶剂（如乙腈等）进行终止反应。然后通过离心等手段进行样本处理，离心条件如13000-15000 rpm离心5-10分钟，然后取上清液进行检测。

④ 检测分析：使用HPLC、LC-MS/MS等分析技术检测样本中的药物原形剩余量及其代谢产物，进而分析药物的半衰期及固有清除率，以此评估其在Ⅰ相代谢中的稳定性。图2为采用LC-MS/MS测定某种药物在人、犬和大鼠肝微粒体中的代谢情况，从图上可知，该药物在三种肝微粒体中均存在明显代谢，但不同种属间又存在显著差异。

图2某种药物在人、犬、大鼠肝微粒体中的代谢情况

（2）原代肝细胞体外温孵法试验方法

原代肝细胞保持了完整的细胞结构，拥有更完整的代谢酶系统和不同清除途径的辅酶因子。可采用原代肝细胞体外温孵法进行药物代谢稳定性试验。

① 原代肝细胞获取与准备：可以从新鲜肝脏组织通过机械和酶消化等方法获取原代肝细胞（人、猴、犬、大鼠及小鼠等种属）。分离得到的肝细胞要进行细胞活力检测，只有活力较高（一般要求在80%以上）的细胞才适合用于后续试验。反应体系中原代肝细胞的浓度可在0.5-2×106/mL之间调整。

② 温孵反应：将原代肝细胞和测试药物（建议终浓度为1μM）于适合的条件（如37℃、5% CO₂）下进行孵育一定时间，如0、15、30、60、90、120min。

③ 终止反应与样本处理：孵育结束后，可通过加入有机溶剂（如乙腈等）进行终止反应。样本离心后取上清液进行检测。

④ 检测分析：使用HPLC、LC-MS/MS等分析技术检测样本中的药物原形剩余量及其代谢产物，进而分析药物的半衰期及固有清除率，以此评估其在Ⅰ相代谢中的稳定性。

由此可见，肝微粒体和原代肝细胞都可通过体外温孵法进行药物Ⅰ相代谢稳定性研究。两者的区别如下所示，客户可根据实际情况进行选择。

【肝微粒体使用场景及选择】

√ 化合物分子水溶性较强，强烈推荐选择肝微粒体。

√Ⅰ相代谢为主要代谢途径(尤其是经由CYP450酶代谢)等情况下，强烈推荐选择肝微粒体。

√ 肝微粒体成本相对较低、易于储存和使用，操作简便，适用于大量化合物的初步筛选、评估化合物代谢稳定性、指导结构修饰等研究。

√ 肝微粒体缺乏完整的细胞结构，无法模拟药物的摄取、转运等过程，试验结果可能与体内实际情况存在一定差异，需要结合其他试验方法进行综合评估。

【原代肝细胞适用场景及选择】

√ 肝微粒体中非特异性蛋白结合较高时，可选择原代肝细胞。

√ 肝微粒体体中代谢不明显时，可尝试使用原代肝细胞。

√ 化合物主要经由醛氧化酶（AO）或者单胺氧化酶（MAO）等非CYP450氧化酶代谢或者水解反应为主要代谢途径时，可选择原代肝细胞。

√ Ⅱ相代谢为主要途径时，选择原代肝细胞。

√ 原代肝细胞具有完整的细胞膜结构和各类药物转运体，更适用于需要模拟真实体内代谢环境、评估药物口服生物利用度、预测人体清除率等研究。但原代肝细胞试验成本较高，操作相对复杂，对实验条件要求较高。

三、IPHASE 体外Ⅰ相代谢稳定性试验数据分析

1.代谢正常

一般情况下，体外代谢稳定性试验的要求是：如果药物发生了代谢，则R2>0.9；3个平行数据间的CV%需在15%之内，允许有一个时间点超限；如果有2个时间点超限可依据情况舍点取平均值；如果底物剩余<5%，则CV%值没有限制。如上表所示，该次试验符合体外代谢稳定性的试验要求，是正常代谢的情况。可以看出，该药物在肝微粒体中的半衰期是5.54min，体外固有清除率为250μL/mg/min。

2. 药物在肝微粒体中不代谢

某次在进行肝微粒体药物Ⅰ相代谢稳定性结果统计后发现，随着时间的延长，药物的剩余量基本没有变化，可认为该药物在肝微粒体中没有发生代谢。排除产品本身质量问题后，可能的原因有：（1）药物通过非CYP450酶代谢，而该酶在肝微粒体含量很低，活性较弱；（2）该药物主要代谢途径是Ⅱ相代谢，可尝试进行Ⅱ相代谢稳定性试验观察结果；（3）该药物为慢代谢药物，不适合用肝微粒体代谢模型进行试验。因此，针对Ⅱ相代谢的药物，客户可以尝试使用微粒体进行Ⅱ相代谢稳定性测试，也可以更换为原代肝细胞或者肝S9等体外代谢模型。针对肝微粒体中该药物代谢酶活性低的情况，则需要选择原代肝细胞或者肝S9等模型进行测试。而针对慢代谢药物，常规的微粒体和肝细胞代谢模型无法满足试验要求，可以选择肝细胞共培养系统进行试验。

3. 酶活问题

如上表所示，在进行肝微粒体Ⅰ相代谢稳定性试验时发现，药物在10min后的代谢情况不明显，代谢趋于平缓，从而在进行数据拟合时线性关系不佳（R2=0.7359＜0.9）。出现该情况可能的原因有：（1）酶活问题。代谢该药物的酶在肝微粒体中的含量较低，活性较弱，因此在10min后，药物的代谢趋于平缓，呈现出基本不代谢的情况。此时可尝试适当提高体系中微粒体蛋白的浓度再尝试一下（建议体系中的蛋白浓度≤1mg/mL，蛋白浓度过高会和药物发生非特异性结合）。（2）产品问题或者批间差异。产品本身质量问题或者批次间的差异所致，可更换不同批次的肝微粒体产品进行试验。因此，发生该情况后可进行重复验证，以找到出现该问题的原因。

4. 检测方法或者处理溶剂问题

在实际操作中，可能会遇到这样一种情况：随着孵育时间的延长，在某个时间点后，底物的剩余量反而增多，如图上表中的数据一样，在第10min时，底物剩余量为97%，第15min时，底物剩余量增至105%，之后达到了123%，针对这一“反常”情况，我们分析可能的原因有：（1）检测方法问题。检测方法不合适，底物中包含了代谢产物的峰，导致峰面积变大，此时需要优化检测方法。（2）处理溶剂问题。在终止反应时所用的有机溶剂不合适，可尝试更换终止液（如由乙腈更换为甲醇等）。

综上所述，代谢稳定性是影响化合物暴露量和生物利用度的主要因素之一，在药物的有效性和安全性方面发挥着至关重要的作用。因此，在药物研发初期，进行体外代谢稳定性试验对于预测人体内清除率、筛选优势化合物及构建IVIVE模型等方面具有重要意义。

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