ADME—代谢稳定性研究（Metabolic Stability）
2024-07-17
Q：用微粒体进行Ⅱ相代谢稳定性试验时，孵育体系中丙甲菌素的作用是什么？
微粒体具有膜囊泡状结构，Ⅱ相代谢酶的酶活中心在膜内侧，丙甲菌素是破膜剂，可促使底物进入到膜内，进而与Ⅱ相代谢酶发生反应。
Q：贵司是否有经过肝微粒体反复冻融对酶活的影响验证？
本司验证过2次冻融对肝微粒体酶活是几乎没有影响的，多次冻融肯定会对酶活存在影响，但本司暂未积累多次冻融的酶活影响数据。
Q：：为什么要进行代谢稳定性研究？
首先，代谢稳定性反映了化合物对生物转化的敏感性，若代谢稳定性低，意味着化合物在体内较容易被代谢，往往预示着不良的药代动力学性质，如口服利用度低、作用时间短；其次，代谢稳定性试验得到的人体外内在清除率Clint可用于进行人体清除率的预测；再次，各种属间代谢速率的一致性信息可为安评动物种属的选择提供一定的数据支持。
Q：代谢稳定性试验中，药物浓度该如何选择？为什么？
在代谢稳定性试验中，设置一个浓度的药物浓度即可满足要求，一般为1μM，不建议过高。孵育浓度越高，测得的Clint越低，越失真；理论上，孵育浓度低至<<1μM。
Q：在代谢稳定性研究中，肝微粒体&肝细胞？该如何选择？
在代谢稳定性研究中，选肝微粒体还是选肝细胞，主要还是要看化合物的代谢特性，谁代谢速率高选谁。一般情况下，优先选用肝微粒体，尤其是在化合物分子水溶性较强、一相代谢为主要代谢途径（尤其是经由CYP）等情况下，肝微粒体为最优选择。当有证据显示二相代谢为主要途径、水解作用为主要代谢途径、肝微粒体中非特异性蛋白结合很高、肝微粒体中代谢不明显的时候，可使用肝细胞进行试验。
Q：代谢稳定性试验中，微粒体蛋白浓度该如何选择？为什么？
在代谢稳定性试验中，通常选择的微粒体蛋白浓度为0.1mg/mL~1mg/mL，具体选用多大蛋白浓度需根据化合物自身代谢特性去选择。微粒体蛋白浓度过高，则会导致药物和微粒体蛋白非特异性的结合。
Q：非特异性蛋白结合对试验结果有什么影响？
药物分子在孵育体系中是可以与微粒体蛋白结合的。蛋白浓度越高，游离分数的fu值越小，就会造成实测Clint值与理论上的“真值”差异越大（实测值比理论值小）。必要时，可以通过测定孵育体系中的fu值进行校正。
Q：在代谢稳定性试验中，孵育时间应如何选择？
一般情况下，若选用肝微粒体作为试验系统，孵育时间在60min以内，设置3~5个非0时间点；若选用肝细胞为试验系统，孵育时间控制在120min以内，设置3~5个非0时间点。
Q：孵育体系中有机溶剂的加入对试验结果有什么影响？为什么？
孵育体系中有机溶剂的含量要控制在1%以内。孵育体系中发挥代谢作用的组分是酶，而酶的本质是蛋白，有机溶剂加入过多，会导致酶变性，活性降低或丧失，故孵育体系中要控制有机溶剂的加入量。
Q：半衰期和清除率怎么计算？
将受试物在0min浓度作为100%，各时间点的受试物浓度与0min浓度相比得到剩余百分数。各时间点的受试物剩余百分数的自然对数与孵育时间经线性回归，求得斜率（k），由公式求得各种属微粒体中的消除半衰期t1/2和体外肝微粒体中的固有清除率Clint in vitro。
Q：二相代谢稳定性试剂盒里的A液和B液分别是什么？用途是什么？
试剂盒中的A液和B液是NADPH再生系统的组分，通过反应可得到NADPH。因为有些化合物是先通过一相反应进行转化，如果极性依然较弱，则会启动二相反应，所以试剂盒将一相和二相的辅助因子都囊括了进去。但是，如果只想考察葡萄糖醛酸化反应，可以不使用A液和B液。
Q：药物只做一相代谢可代谢10%，只做二相代谢也只代谢10%，但使用二相代谢试剂盒却可代谢50%，如何解释？
药物的生物转化，分为一相代谢反应和二相代谢反应。药物在一相代谢反应中主要发生氧化、还原和水解的反应，经过一相代谢反应，药物可能带有一些极性基团，如羟基、羧基等。二相代谢，又称结合反应，一相代谢产物或原型药物在酶的影响下与内源性小分子发生结合，使药物毒性、活性降低或极性增加而易于排出的反应。一般来说，药物先进行一相反应进行转化，如果极性依然较弱，则会启动二相反应，但有些药物可直接进行二相反应。所以，才会有以上现象的存在。
Q：0min的代谢点总是会发生代谢反应，该如何处理？
建议先加入终止液，再启动代谢反应。
Q：化合物在水相中溶解度不好，如何进行代谢稳定性研究？
建议使用肝细胞为代谢系统进行稳定性研究，若选用肝微粒体为试验系统，可采用单管加样、震荡孵育的方法进行试验。
Q：化合物在有机溶剂中可以检测到，但加入试剂盒后检测不到？
初步判定可能是化合物在水相中溶解度不好或者化合物在水相环境中易水解导致的。若是由于在水相中溶解度不好导致，可优化样品前处理过程；若相同浓度化合物在水溶液和有机溶剂的响应相差50%以上，判定化合物易水解（0.1 M PBS对某些化合物而言，可能存在基质效应，判定前需排除基质效应影响），不易进行体外代谢试验，建议确认化合物发生药效是化合物本身还是其水解产物。
Q：使用试剂盒中阳性底物，通过底物消除法进行试验，未发生代谢反应？为什么？
组装在试剂盒中的阳性底物浓度为10mM，即使按1μL的加入量进行添加，终浓度也可达50<μM，该浓度适宜检测代谢产物生成。因孵育体系中微粒体酶的含量有限，如需检测阳性底物的减少，需将其进行稀释后再进行试验，推荐终浓度为1μM。
Q：代谢稳定性研究试剂盒中阳性底物的作用是什么？孵育时间点应如何设置？
试剂盒中阳性底物的作用主要是为了证实试剂盒的有效性。孵育时间点的设置主要看是基于什么试验目的，若只是为了验证孵育系统是否正常工作，仅需设置0点和一个非零时间点即可；若需考察阳性底物的代谢稳定性特征，则需设置0点和3~5个非零时间点。
Q：试剂盒中组分一次用不完，该如何保存？为什么？
试剂盒中微粒体、A液、B液、UDPGA等组分均含有酶的成分，反复冻融会导致酶活性降低或丧失，一次用不完，建议按照使用量进行分装并做好标记，按照试剂盒标识的保存温度保存。
Q：：为什么对照组是必须的？
对照组的目的是考察化合物本身在不同组分中的稳定性，对照组结果稳定是整个代谢试验成立的前提条件。
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