体外小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变试验常见问题——《药物遗传毒性研究技术指导原则》
2021-10-15
体外小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变试验常见问题——《药物遗传毒性研究技术指导原则》
2021-10-15
（三）体外小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变试验（In vitro mouse lymphoma cell Tk gene mutation assay，MLA）
1.细胞
通常采用小鼠淋巴瘤L5178Y tk+/- 3.7.2 C细胞（注释16）。细胞系需定期检查核型或有无支原体污染等，必要时进行自发突变细胞的清除。-80℃或液氮冻存备用。
2.浓度
至少应包含4个可用于结果分析的浓度。
最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度：
（1）对于可溶性的无细胞毒性的受试物，推荐的最高浓度一般为1mM或0.5mg/ml （选用较低者）。
（2）对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度，最高浓度应能产生80%～90%的细胞毒性。通过相对总生长率（Relative total growth，RTG）来反映细胞毒性。
（3）对于难溶性的受试物，若无细胞毒性，一般采用最小沉淀浓度作为最高浓度；即使细胞毒性出现在最小沉淀浓度以上，一般建议只检测1个沉淀浓度，因为沉淀可能产生干扰。
对最高浓度之下的其他浓度，对于细胞毒性小或无的受试物，一般浓度间距为2～3倍；对于有细胞毒性的受试物，所选择的浓度应覆盖产生细胞毒性的范围，并且包括具有中度或少/无细胞毒性的浓度；在一些情况下，如受试物具有较陡峭的浓度反应关系，可适当缩小浓度间距或将检测的浓度增加至4个以上。
3.代谢活化
一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终浓度一般为1%～10%（v/v）。
4.对照
代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性诱变剂。
5.方法
一般采用微孔法或软琼脂法进行试验。以微孔法为例：
处理时间：在代谢活化或非代谢活化条件下，一般受试物与细胞作用3～4小时。如果作用3～4小时后结果为阴性，还需进行在非代谢活化条件下作用24小时的附加试验。
突变表达期：受试物与细胞作用结束后，去除受试物，将细胞重悬于培养液中，一般L5178Y细胞的突变表达期为2天。分别在处理结束后及表达期结束后测定平板接种效率以评价细胞毒性。
突变率测定：表达期结束后，将细胞接种于含有突变选择剂三氟胸苷（TFT）的96孔板中进行TFT抗性突变集落的测定。如果受试物出现阳性结果，需要对至少一个受试物浓度组（一般为最高浓度）和阴性、阳性对照组分别记录含有大、小集落的孔数；如果为阴性结果，仅需要对阴性和阳性对照组分别记录含有大、小集落的孔数。
6.结果判定
结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况；结果表示为各浓度组的突变率（Mutant frequency，MF）。
MLA试验中阴性对照组和阳性对照组必须符合以下标准才可判定MLA试验成立。
阳性对照组的突变率、突变选择时的克隆率、悬液增长应满足以下条件：
表1 MLA成立的阴性对照组标准
参数 软琼脂法 微孔法
突变率（MF） （35～140）×10-6 （50～170）×10-6
克隆率 65%～120% 65%～120%
悬液增长 8～32倍（3～4小时处理）
32～180倍（24小时处理） 8～32倍（3～4小时处理）
32～180倍（24小时处理）
阳性对照组应满足以下条件之一：
（1）总突变率绝对增加，比自发背景突变率增加[即诱导MF（IMF）]至少300×10 -6，至少40%的IMF应该在小菌落MF中。
（2）与同期阴性对照组比较，小菌落MF增加至少150×10-6。
MLA中突变率的增加具有生物学意义的评价标准为，在任何一种试验条件下，如果一个或多个浓度组的突变率增加超过总评价因子（Global evaluation factor，GEF）（GEF为诱导突变率，即高于同期阴性对照的突变率的增加。软琼脂法GEF为90×10-6，微孔法为126×10-6），且呈浓度依赖性，判定为阳性结果。如果在所有试验条件下各浓度组的突变率无浓度依赖性增加或突变率的增加未超过GEF，判定为阴性结果。
如果出现明确的阳性或阴性结果，不需要重复试验。如果结果不是明确的阳性或阴性结果，或者为了帮助确定结果的生物学意义，应对数据进行专家同行评议和/或进一步研究。在重复试验中改变试验条件（如改变试验浓度间距、改变代谢活化条件和处理时间等）可能是有用的。
7. TK基因突变试剂盒中细胞稀释时倍数选择是什么样的?
本司一般为10倍稀释，稀释倍数过高容易造成较大误差，稀释倍数过低试验操作复杂。
8. TK基因突变试验中添加丙酮酸纳的意义是什么?
在TK基因突变试验中，丙酮酸钠的应用有助于减少因氧化应激引起的DNA损伤，进而降低突变频率。这种作用对于评估化学物质的诱变性和抗诱变性具有重要意义，因为它能够提供一个相对较低的突变背景，使得试验结果更加准确可靠。
9. TK基因突变试验的一些关键点是什么?
(1)：筛选细胞后应将正式试验时间控制在1周内，减少传代次数，避免出现细胞自发突变频率高等问题；
(2)：正式试验铺板时，应将细胞稀释倍数控制在合理的范围内，采用排枪将摇匀的细胞进行铺板，保证细胞的均匀性；
(3)：添加TFT后对细胞活性的判定，本司采用MTT方法，活细胞呈现紫色，可通过细胞颜色明确细胞活性，更加准确进行大、小集落数量的判断。
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