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轻松搞定原代肝细胞分离提取，关键在这！

2025-04-02

Keywords：原代肝细胞；Primary Hepatocytes; 肝细胞分离；肝细胞提取; Hepatocyte Isolation Protocol；Isolation of Primary Hepatocytes

肝脏作为药物暴露的主要器官，在药物的代谢和毒性过程中起着至关重要的作用。原代肝细胞（Primary Hepatocytes）具有完整的细胞特性和生理水平的酶和辅助因子，既包括膜结合酶【如细胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶】，也包括胞质酯酶，拥有肝脏中所有的代谢途径。因此，原代肝细胞（Primary Hepatocytes）被广泛认为是构建体外肝脏模型的金标准，在药物相互作用、药物代谢和药物毒性研究中受到研究者的青睐。

一、原代肝细胞分离方法

肝细胞分离（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝细胞提取提取有直接剪切法、组织块培养法、胰蛋白酶消化法、两步胶原酶灌注法（Seglen灌注法）、半原位胶原酶灌注法等。

【直接剪切法】

原理：将肝脏切成小块，然后用胶原酶或胰蛋白酶进行消化，分离得到肝细胞。

优点：操作简单，适用于大量细胞的分离。

缺点：细胞损伤较大，纯度较低。

【组织块培养法】

原理：将肝脏切成小块，在培养皿中加入含特定生长因子的培养液进行培养，使组织块贴壁生长，然后逐渐分离得到肝细胞。

优点：能够保持细胞的天然状态，适用于长期培养。

缺点：操作较为繁琐，细胞数量较少。

【胰蛋白酶消化法】

原理：用胰蛋白酶或胰酶对肝脏进行消化，分离得到肝细胞。

优点：能够较为彻底地分解细胞间物质，获得较纯的肝细胞。

缺点：胰蛋白酶的价格较贵，成本较高。

【两步胶原酶灌注法（Seglen灌注法）】

原理：用含有胶原酶的溶液通过门静脉灌注到肝脏中，使肝实质细胞与间质分开，然后收集分离得到肝实质细胞。

优点：能够保持细胞的天然状态，适用于长期培养。

缺点：操作较为繁琐，细胞数量较少。

【半原位胶原酶灌注法】

原理：将肝脏放置在特定装置中，通过门静脉灌注胶原酶溶液，使肝脏在生理状态下进行消化，然后收集分离得到肝实质细胞。

优点：能够较为真实地模拟生理状态，获得的细胞形态、活性较好。

缺点：操作较为复杂，成本较高。

其中，两步胶原酶灌流法因其对肝细胞损伤作用较小，肝细胞产率和存活率高，成为了分离原代肝细胞的经典方法。

二、原代肝细胞分离流程

鉴于此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，在两步胶原酶灌注的基础上，开发了原代肝细胞分离试剂盒，有标准的分离流程（Hepatocyte Isolation Protocol），其内整合了包括灌流液、胶原酶、细胞洗涤液、细胞纯化液、试验耗材等在内的所有组分，可适用于大鼠、小鼠等多个种属原代肝细胞的分离。以下为详细实验流程：

1、实验材料

1)动物：空白健康的6~8周雄性SD大鼠

2)仪器：恒温水浴锅、水平离心机、移液器、生物安全柜

3)试剂：胶原酶、灌流溶液A、灌流溶液B、消化终止液、分离液添加剂、肝细胞纯化液

4)耗材：0.22um过滤器、20ml无菌注射器、10ml无菌注射器、5ml无菌注射器、无菌纱布、无菌剪刀、无菌镊子、无菌烧杯、无菌擦手纸、无菌50mL离心管及巴氏吸管

2、试剂预处理

1)灌流溶液A：实验前37℃水浴预热30分钟。

2)灌流溶液B：实验前每100mL灌流溶液B中加入1支胶原酶，充分溶解后用0.22µm过滤器过滤。过滤后的溶液加入100uL分离液添加剂，然后37℃水浴预热30分钟。

3)消化终止液：实验前在无菌条件下，每100mL消化终止液中加入100uL分离液添加剂，混匀后置于冰上备用。

3、实验步骤及结果

(一) 肝脏获取

1)尽可能于半分钟内将大鼠断颈处死后用75%酒精喷洒进行全身消毒，并转移至生物安全柜中。

2)用镊子将大鼠下腹部皮肤提起，并使用剪刀从下往上将大鼠腹部表皮剪开，以裸露腹部肌肉部位。

3)更换剪刀将大鼠肌肉部位剪开，使肝脏充分暴露，注意不要将大鼠内脏器官剪破。

(二) 组织处理

1)用剪刀剪开图A所示位置，剪至能清晰可见每叶肝脏上都有较为明显的静脉孔，使用20mL注射器从静脉孔处灌注灌流液A，将每叶肝脏都灌注至土黄色。

2)使用10mL注射器从静脉孔处灌注灌流液B，直至肝脏软烂。

(三) 细胞获取

1)用镊子将肝脏摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL离心管中并用剪刀将其充分剪碎至泥状，补加灌流溶液B至30mL.

2)37℃水浴消化约3min,期间用巴氏吸管不断搅拌。

3)消化结束后按照混悬液与消化终止液1：1的比例加入消化终止液。

4)无菌纱布过滤即得肝细胞悬液。

(四) 细胞洗涤

1)将肝细胞悬液轻轻颠倒混匀，分装至50mL离心管。

2)70g（升速 3、降速 3）、4℃离心 5min。

3)在超净工作台中弃上清，消化终止液重悬细胞沉淀。

(五) 细胞纯化

1)按照 7：3 的比例（即细胞悬液：肝细胞纯化液）加入肝细胞纯化液并混匀。

2)100g（升速 3、降速 3）、4℃离心 10min。

3)弃上清，使用冻存液将细胞重悬，并于液氮罐中保存。

如图所示，该图为IPHASE技术人员此次共分离得到的SD大鼠新鲜肝细胞照片，经0.4%台盼蓝染色后发现细胞活率在90%以上，且数量共有80million，说明以IPHASE原代肝细胞分离试剂盒为提取材料，可获得纯度高、活率好且数量多的新鲜原代肝细胞！

三、IPHASE相关产品

IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，深刻识到原代肝细胞（Primary Hepatocytes）是构建体外肝脏模型的金标准，在药物相互作用、药物代谢和药物毒性研究中受到研究者的广泛青睐。因此，在两步胶原酶灌注法的基础上研发了原代肝细胞分离试剂盒，在标准的肝细胞分离流程（Hepatocyte Isolation Protocol）下进行肝细胞分离（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝细胞提取，并以SD大鼠为实例，证明该试剂盒、该方法具有实用性！除此以外，IPHASE以相似分离流程，研发、生产了多种属、多规格及多性别的悬浮或贴壁原代肝细胞，供客户购买使用，为客户缩短时间，节约成本！

产品	种属	规格
原代肝细胞分离试剂盒	多种属	1套
新鲜/冻存悬浮肝细胞	人/猴/犬/大鼠/小鼠/猫/猪/兔/鸡/金黄地鼠	2/5 miliion
新鲜/冻存贴壁肝细胞	人/猴/犬/大鼠/小鼠/猫/猪/兔	2/5 miliion
培养基	复苏/铺板/维持/代谢	10/20/50 mL
胶原包被板	6/12/24/48/96孔	1/5块
超低吸附培养板平底	6/12/24/48/96孔	1/5 个
超低吸附培养板U底	96孔	1/5 个