遗传毒性—Ames试剂盒
2024-07-17
Q： 要开展Ames试验，如何选择溶媒/赋形剂？
A：不同剂量浓度样品的制备是开展Ames试验的前提，制备符合试验要求的样品也有一些行业要求需要遵守。第一,溶媒/赋形剂的选择原则是其不与受试物发生反应，对菌株和S9没有毒性，没有诱变性；第二，首选蒸馏水，对于不溶于水的受试物可选择其它溶媒/赋形剂，若受试物对水不稳定，应选用不含水的有机溶剂或赋形剂；第三，若选用有机溶剂作为溶媒，首选DMSO，也可选其它溶媒，若选用的是不常用的溶媒或赋形剂，应有资料说明其理由，且若选用有机溶剂做为溶媒，每平板最高添加量不超过0.1mL。
Q： Ames试验的最高剂量组应如何确定？
A：Ames试验最高剂量组的确定取决于受试物对试验菌株的毒性和受试物的溶解度。建议先进行预实验测定受试样品的毒性和溶解度，应根据受试样品对细菌的毒性和在配制的最终混合物种的溶解度确定受试样品的最高剂量组。可将回变菌落数的减少、背景菌苔体积变小或处理后细菌存活率降低等作为细菌毒性的指征。
Q： Ames试验组别如何设置？
A：Ames试验通常需要包含未处理对照组（自发对照组）、阳性对照组（标准诱变剂对照组）溶媒对照组和样品剂量组四个组别的试验。需要注意的是，若溶解样品使用的溶媒和标准诱变剂使用的溶媒不一致时，还需加做DMSO的对照，且样品剂量组数量不同领域的要求会存在一定差异，需关注具体参照的标准或导则。
Q： 为什么要在有和没有代谢活化系统的情况下试验？
A：代谢活化系统是诱导S9和辅因子的混合溶液。诱导S9本身是经药物诱导后的动物肝脏的组分，诱导的目的是让酶活得以放大。加代谢活化系统组评估的是代谢产物的遗传毒性，而不加代谢活化系统组评估的是原药的遗传毒性。对于未知化合物，因不确定是其自身，还是其代谢产物会有遗传毒性，故需在这两种情况下同时进行试验。
Q： Ames试剂盒可以检测几个样品？
A：Ames试剂盒可完成一个样品的Ames检测。Ames试剂盒（5菌版/正式试验）规格为250皿/盒，可在有和无代谢活化系统、5个菌株、三个平行的情况下进行对照组（未处理对照组、溶媒对照组、阳性对照组）和样品的5个剂量组的遗传毒性检测；Ames试剂盒（2菌版/预实验）规格为150皿/盒，可在有和无代谢活化系统、2个菌株、三个平行的情况下进行对照组（未处理对照组、溶媒对照组、阳性对照组）和样品的8个剂量组的遗传毒性检测；微量波动Ames试剂盒的规格我96孔*16板，可在有和无代谢活化系统、2个菌株、48孔/处理组的情况下进行对照组（未处理对照组、溶媒对照组、阳性对照组）和样品的5个剂量组的遗传毒性检测。
Q： 试剂盒中菌株可不可以传代培养？
A：不建议对试剂盒中的菌株进行传代培养。原因主要有以下三点：第一，Ames试剂盒中菌株是以冻存菌液形式提供，可满足Ames试验要求，收到货后无需进行其它处理，可直接用于试验；第二，因Ames试剂盒中菌株均为营养缺陷型菌株，频繁处理可能使得其某些特性丢失； 第三，Ames试验对菌株不但有浓度的要求，而且有自发和阳性突变菌落数的要求，国标或指导原则中虽然写的较为简单，但真正要达到其要求却很难。
Q： Ames试剂盒是否可分多次去使用？
A :Ames试剂盒试剂盒中菌株和S9复合物不建议反复冻融使用，如需分次多次试验，建议按照菌株分次进行。Ames试剂盒中菌株为营养缺陷型菌株，且以冻存菌液形式提供，反复冻融一方面可能会导致其某些特性丢失，另一方面也会直接导致自发回变数和阳性诱变剂回变数达不到标准或指导原则要求。S9复合物在Ames试验中是作为代谢活化系统，而发生代谢主要是酶的参与，反复冻融会导致酶活降低，可能会导致试验结果的假阴性。
Q： 当受试物（如某些抗生素）对细菌有高毒性时是否还需进行Ames试验？有没有其它验证方法？
A：当受试物对细菌有高毒性时，仍应进行Ames试验，因为致突变性可能出现在较低的、毒性较小的浓度。为了减少具有潜在遗传毒性的化合物产生假阴性结果的风险，遗传毒性的研究通常需要多个试验的组合。任何一项遗传毒性试验中的阳性结果并不一定能说明化合物对人类真正具有遗传毒性或致癌性的危险。故可以加做其它试验，如基因突变试验、染色体畸变试验。
Q： 在实验的过程中，可能会因为化合物的溶解性不好，导致无法区分是菌落还是沉淀，该如何处理？
常规的要求是平皿中可以有未溶解的化合物，但是沉淀的存在不能影响到菌落计数。若这种情况无法避免，可以培养48h后先进行一次菌落观察和计数，并继续培养至72h，若生长则可判定为菌落，也可挑取菌落接种至培养基培养观察是否生长。
Q： 试验过程中加S9组比不加S9组菌落数要高，是否正常？
A：这种情况属正常现象，但即使偏高也会在国标或导则的要求范围内。可能是因为肝S9本身有痕量的氨基酸成分，可为会菌提供营养。
Q： 受试物浓度低未检出遗传毒性还是本身无遗传毒性？该如何判断？
A：一方面，Ames试验的要求是，若试验结果为阴性，需进行验证，即需改变试验条件进行重复试验。另一方面，为了减少假阴性结果的风险，遗传毒性的研究通常需要多个试验的组合，可补做基因突变、染色体畸变、微核等其它试验。
Q： ：医疗器械：浸提溶剂为什么选择水？按照标准应该选择生理盐水或DMSO。
A：关于医疗器械的浸提属于样品前处理的过程，试剂盒中未提供，需自行进行准备。试剂盒适用于多个领域的Ames检测，具体到每个领域，可能会有一定差异。
Q： Mini-Ames试剂盒（5菌版）需要的化合物的量是多少？
A：Mini-Ames采用的是6孔板，每孔的受试物的最高剂量是1mg，对于5个菌株来讲，所需要的化合物的量是5（5个菌株）×3（3个平行重复）×2（+/-S9）×2（配制2份，一份是最高剂量，一份用于其他剂量的稀释）=60mg，也就说是，完成一次Mini-Ames试验，最少需要化合物的量是60mg。
Q： Mini-Ames试验，每孔加入的顶层培养基的量是多少？
Q： 体外遗传毒理试验试剂盒，比如Ames试验，染色体畸变试验，微核试验，TK基因突变实验，每个试验的周期是多久？
A：使用试剂盒的话，Ames试验的周期是5-7天，染色体畸变试验前期是5-7天，微核试验前期是7-9天，但染色体畸变和微核试验需要人工阅片，至少需要半个月时间，TK基因突变需要24-28天。
Q： 你们用于Ames试验的菌株来自哪里，出厂前进行了哪些鉴定？有做基因测序吗？
A：我们的菌株是来自于美国MOLTOX公司，出厂前会经过生物学特性鉴定，Ames试验验证等，不进行基因测序。
QQ： 在AMES试验过程中，顶层培养基非常快就凝固了？
.推荐使用的培养皿的规格是90mm。
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