CYP450酶代谢表型研究(化学抑制法)原理及实验方法

2022-06-17

1    概述

1.1 药物代谢研究简介

药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。

药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物的检测具有一定的困难。体外代谢法在短时间内可以得到大量的代谢产物，且代谢条件可控，代谢体系比较“干净”，代谢物易于分离、提取，有利于代谢途径研究及代谢产物结果的确定等，因而，体外代谢法具有突出的优越性。

由于肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，研究体外代谢方法主要有：肝微粒体体外温孵法、重组P450酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏离体灌流法和肝切片法。其中，肝微粒体体外温孵法与其他体外代谢方法相比，酶制备简单，代谢过程快，重现性好，易大量操作，同时可用于药物代谢酶的抑制及体外清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。

1.2 CYP450酶代谢表型研究的重要性

药物代谢酶表型鉴定，主要是研究参与药物清除的代谢酶的类型、数量和相对贡献率。如果药物主要通过单一的代谢途径对药物进行清除，可能会存在很大的用药风险；相反，如果某一药物的代谢过程涉及的代谢酶越多，则说明其代谢途径也越多，也就难以发生潜在的药物-药物相互作用，使得患者之间的治疗偏差降低。因此，在新药临床前研究中，对药物的代谢酶表型进行鉴定，获得其主要代谢酶的消除比例，阐明参与药物体内代谢转化的相关酶亚型，对于研究药物的代谢机制，预测药物代谢多态性和药物间相互作用等方面具有重要意义。

1.3 CYP450酶及代谢表型研究方法

CYP450为一类含亚铁血红素蛋白的超家族，根据相关酶亚型在药物代谢中的重要程度，可将CYP450分为以下三类：（1）主要CYP450，包括CYP1A2、CYP2C9 、CYP2C19 、CYP2D6 和CYP3A4；（2）较主要CYP450，包括CYP2B6、CYP2C8和CYP3A5；（3）次要CYP450，包括CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2E1、CYP2J2和CYP4A11等。参与药物代谢的动物肝微粒体P450酶较为复杂，而人肝微粒体中参与药物代谢的P450酶相对比较简单，主要有CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E和CYP3A，其组成见图1。

图1 人肝内P450酶的组成

目前，CYP450的酶表型鉴定主要使用以下3种方法：选择性抑制法、重组人源CYP450同工酶法、相关性分析法。选择性抑制法又分为化学抑制法和抗体抑制法，即在加入和不加入一系类CYP450酶亚型选择性化学抑制剂或抗体的条件下，分别测定人肝微粒体对药物的代谢活性，以考察人肝微粒体中CYP450酶亚型倍选择性抑制后，药物的代谢是否受到影响，从而计算相对抑制百分率，推断CYP450酶代谢表型。其中，化学抑制法由于其操作简单，且价格低廉而得到广泛应用。

2    实验原理

参与药物代谢的CYP450酶主要为CYP1、CYP2和CYP3三个家族，其中CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4/5是主要的药物代谢酶。CYP2B6和CYP2C19在体外没有特异性的选择性抑制可用，一般还需结合重组酶法进行其表型确定。噻氯匹定是CYP2B6的抑制剂，诺卡酮是CYP2C19的抑制剂，α-奈黄酮为CYP1A2的特异的选择性抑制剂，槲皮素为CYP2C8的特异的选择性抑制剂，磺胺苯吡唑为CYP2C9的特异的选择性抑制剂，奎尼丁为CYP2D6的特异的选择性抑制剂，酮康唑为CYP3A4/5的特异的选择性抑制剂，如选用特异的选择性抑制剂抑制不同亚型的酶的活性，便可通过化学抑制法研究药物的CYP450酶代谢表型。

3    实验方法描述

肝微粒体体外温孵法是采用肝微粒体，辅以NADPH再生系统（IPHASE汇智和源），在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间的反应后，采用HPLC、LC-MC和LC-MC/MC等测定温孵液中原型药物或其代谢产物的浓度，分析其主要代谢途径。

3.1 肝微粒体制备

P450酶主要在肝脏中表达，肝脏中的P450酶在体外是以微粒体的形式存在的。微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。目前，制备肝微粒体常用的方法是差速离心法。具体制备流程见下图（图2）：

图2 肝微粒体制备流程图

3.2 体外孵育体系的建立

CYP450酶代谢表型研究的肝微粒体体外孵育体系，是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，再加入酶特异的选择性抑制剂，在模拟生理温度及生理环境的条件下进行生化反应的体系。

推荐使用的孵育体系为：每个孵育体系总体积为200 µL，体系包括0.1M PH 7.4 的磷酸缓冲液，汇智和源NADPH再生系统（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，3.3 mM的氯化镁）；适当浓度的肝微粒体蛋白；适量的选择性抑制剂；合适浓度的待测物，于37°C水浴孵育，每个样品平行3次，以不加选择性抑制剂组为对照。于预设的反应时间点，加入等体积预冷的乙腈终止反应。

3.3 原型药物或代谢产物的检测

采用HPLC、LC-MC和LC-MC/MC等测定温孵液中原型药物或其代谢产物的浓度。

例：

下图（图3、图4、图5）为研究某一候选药物的CYP450酶代谢表型的实验，该实验采用选择性化学抑制剂的方法分析了该药物在鼠、犬和人肝微粒体中的代谢情况，从而判断微粒体中哪些CYP450亚型是该药物的主要代谢酶。

数据计算：

用待测物的消除速率表示待测物在微粒体孵育体系中的代谢速率。

抑制率%=（1- 加入抑制剂样品代谢速率/空白对照样品代谢速率）×100%

图3 大鼠肝微粒中某药物的代谢抑制率

图4 犬肝微粒中某药物的代谢抑制率

图5 人肝微粒中某药物的代谢抑制率

从上图可知，不同种属微粒体中，该候选药物的代谢抑制率存在差异。表明，不同种属微粒体中参与该候选药物代谢的酶亚型可能不同。

4    CYP450酶代谢表型研究试剂盒简介

本公司针对CYP450酶代谢表型研究的需要，以肝微粒体体外温孵法为指导，以化学抑制法为基础，开发了一款专门用于CYP450酶代谢表型研究的试剂盒，该产品可直接用于药物CYP450酶代谢表型研究，省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程，大大缩短了实验周期，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，符合CYP450酶代谢表型研究试验要求，实验结果准确、可靠、重现性好。

4.1 产品说明

本产品提供了采用化学抑制法进行CYP450酶代谢表型研究的所有试剂，可直接用于药物CYP450酶代谢表型的研究，省去了试剂配制的繁琐过程，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性好。

根据微粒体种属的不同，可根据实际需求选择人肝微粒体、恒河猴肝微粒体、比格犬肝微粒体、大鼠肝微粒体和小鼠肝微粒体中的一种。

4.2 试剂盒优势

便捷——本试剂盒省去了肝微粒体制备和试剂配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。

准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。

稳定——本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。

4.3 产品组成

50反应/盒，200μL/反应。

4.4 产品使用说明

4.4.1 试验组

1）冰浴融化试剂盒各组分，置于冰上待用；

2）除微粒体外，将孵育体系其它各组分按照配比混合并吹吸混匀，于37℃预孵育5min；

3）将以上混合液195μL/管分装至2.0mL离心管中，于37℃水浴中保温， 5μL/反应加入肝微粒体，吹吸3次混匀于37℃水浴条件下启动代谢反应，使用秒表计时；

4）于设定孵育时间点，向孵育体系中加入终止液终止反应（如预冷乙腈，预冷乙腈体积：孵育体系体积=1:1）。

例：200μL孵育体系配制：

注：a.体系中有机溶剂加入量不得大于1%；

b.若实际需要n个孵育体系，则需配置n＋1个体系。

4.4.2对照组：

1）阳性底物组：反应体系中不加选择性抑制剂，并将受试物换为阳性底物，其它组分加入量不变，缺少体积用0.1M PBS缓冲液补齐；

2）无抑制剂组：反应体系中不加选择性抑制剂，其它组分加入量不变，缺少体积用0.1M PBS缓冲液补齐；

无A、B液组：反应体系中不加A液和B液，其它组分加入量不变，缺少体积用0.1M PBS缓冲液补齐。

4.4.3结果计算：

采用底物消除法评价试验结果，用待测物的消除速率表示待测物在微粒体孵育体系中的代谢速率；

抑制率%=（1-加入抑制剂样品代谢速率/无抑制剂组样品代谢速率）×100%

4.5 使用注意事项

1）试验开始前，请自行准备2.0mL离心管、不同规格枪头、37℃水浴锅等；

2）本产品仅供科研使用，不能用于人体及动物的治疗或临床诊断；

3）使用前，需于冰浴条件下解冻并混合均匀；

4）于-70℃冰箱冷冻保存，切勿反复冻融；

5）在使用过程中，也可根据实际实验需求调整试剂盒使用方法和各组分的加入量；

6）因CYP2B6和CYP2C19在体外没有绝对特异的抑制剂可用，故结果分析还需结合其它结果进行，如重组酶法的结果。

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