IPHASE/汇智和源 转运体研究试验原理、试验设计及常见问题解答
2024-12-10
Q：如何评估吸附能力强的化合物分子是吸附在细胞表面或是转运进入内部？清洗次数如何确定？
A：实验组细胞通过和MOCK细胞进行对比，吸附能力强的化合物分子会在转运体细胞和MOCK细胞上同时吸附，而转运体细胞可将化合物转运进细胞，MOCK细胞不能进行转运，通过检测结果即可判断。清洗次数可以对每次清洗的上清液进行检测，当清洗相应次数后上清液检测不到待测化合物时，即可确定清洗次数。
Q：PROTAC，小核酸吸附强是否可以用膜囊泡？
A：对于PROTAC分子或小核酸这类吸附性强的化合物，使用膜囊泡模型是合适的，因为膜囊泡可以使ABC转运体的底物结合位点暴露于细胞外缓冲液中，更适用于研究候选药物作为底物和抑制剂与ABC转运体的相互作用。
Q：瞬转SLC细胞在液氮冻存，时间久了是否会影响蛋白活性？
A：SLC转运体瞬时转染会随着时间延长，蛋白活性会逐步降低。
Q：SLC转运体细胞在药物作用前去掉培养液后，是否需要用反应缓冲液预孵育几分钟？
A：通常情况下，去掉培养液后，细胞可能会需要一段时间来适应新的环境，使用反应缓冲液预孵育可以帮助细胞稳定，减少由于环境变化引起的影响。
Q：实验过程中最后一步裂解囊泡除了乙腈是否可以使用其他的有机试剂？如果离心离不下来是否和裂解试剂不合适有关？
A：强碱类（NaOH），甲醇等均可以，离心推荐转速8000rpm-16000rpm，离心力过低不易离心下去。
Q：不同表达宿主，Sf9和HEK293，表达出来的Vesicle细胞是否会有差异？
A：Sf9和HEK293作为不同的宿主在蛋白质修饰、折叠和分泌机制不同，相较于SF9而言，HEK293（人胚胎肾）细胞表达的Vesicle细胞其蛋白质修饰和分泌机制更接近人体自然状态下的生物过程。
Q：早期化合物多筛选阶段主要推荐做哪几个转运体实验？
A：主要推荐的转运体实验包括底物抑制实验和转运活性实验，包括指南推荐的7种SLC转运体。
Q：做囊泡实验使用的反应管是每个单独的吗？
A：是的，实验设计会使用单独的反应管来进行囊泡实验，这样可以为每个样本提供更灵活的操作和处理条件。
Q：选择微孔板过滤器时，PVDF材质和Glass Fiber这两种材质有何区别？
A：PVDF材质和Glass Fiber各有特点，PVDF具有良好的化学稳定性和耐热性，而Glass Fiber则提供了较高的孔隙率和流速。针对囊泡裂解使用的是乙腈，PVDF材质效果更好。
Q：若低中浓度做出来不是转运体的底物，高浓度做出来是，具体是什么原因？
A：首先需要确定低中浓度的范围是否仪器可以检测到，例如选取的底物浓度在仪器的检测基线以下，则无法反应准确的转运活性。
Q：对于OATP1B1和1B3，采用共孵育也可以达到要求，是否还需要预孵育？
A：参照指导原则推荐，OATP1B1和1B3存在时间依赖性抑制，需要进行预孵育。
Q：囊泡的结果如何评判？
A：根据指导原则的要求，待测底物转运活性大于2倍，且通过已知抑制剂抑制率大于50%，即可判定为ABC转运体的底物。待测抑制剂，需通过已知底物检测，抑制率大于50%即可判定为ABC转运体的抑制剂。
Q：反应条件是水浴锅还是摇床？
A：37℃水浴锅或者摇床都可以，但摇床需要静止。
Q：囊泡、细胞、PAMPA三种实验是否有必要都做？若只做一种，优先级是否为表达转运体的细胞实验？
A：囊泡、细胞和PAMPA三种实验各有优势和局限性。囊泡实验可以提供关于转运体功能的直接信息，细胞实验可以模拟体内环境，而PAMPA则是一种快速筛选工具。如果只做一种实验，过表达转运体的翻模囊泡更接近人体自然状态下的生物过程，同时便于检测，因此优先级较高。
Q：SLC转运体细胞药物作用终止后，用乙腈、甲醇等有机溶剂或反复冻融方法是否都可以裂解细胞？
A：是的，乙腈、甲醇等有机溶剂以及反复冻融方法都可以用来裂解细胞。
Q：高通透性化合物为什么不需要预孵育？透膜的能力是否和转运蛋白结合能力一致？
A：高通透性化合物不需要预孵育是因为它们可以迅速通过细胞膜，不需要额外的时间来与转运蛋白结合。透膜能力和转运蛋白结合能力并不总是一致的，因为它们受多种因素的影响，包括分子大小、电荷、脂溶性等。
Q：囊泡是否能摇？
A：底物与囊泡孵育过程需要静置，都处于游离状态时，底物与囊泡不易结合进行转运。
Q：不能用水浴锅是否因为配套的管子不是封闭的？
A：配套的微孔过滤器适用于囊泡的后半部分进行清洗过程，前期孵育需自备普通1.5ml离心管，或者PCR小管。
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